分光光度法測定靈芝孢子油中總三萜的含量

李維嘉，王志強，許澤群，梁潔怡，林晨

（中國廣州分析測試中心，廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東廣州510070）

靈芝為多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma lucidum Karst），或紫芝（Ganoderma sinense）的干燥子實體[1]。外形呈傘狀，菌蓋腎形、半圓形或近圓形，為多孔菌科真菌靈芝的子實體。具有補氣安神、止咳平喘的功效，用于治療眩暈不眠、心悸氣短、虛勞咳喘。主要分布于浙江、黑龍江、吉林、安徽、江西、湖南、貴州、廣東、福建等地[2-4]。靈芝具有雙向調節(jié)人體機能的作用，能過雙向調節(jié)人體機能平衡，使人的免疫系統(tǒng)得到快速的提升，恢復人體的內臟和細胞達到正?；痆5-6]。因此靈芝具有很高的天然藥用價值和食用價值，為人們的生活提供更健康的保障[7-8]。

靈芝孢子油是通過超臨界二氧化碳流體萃取技術從破壁的靈芝孢子中提取的疏水性油狀脂質物，具有抗腫瘤、提高免疫、抗病毒等多種作用[9-10]。其中豐富的靈芝總三萜是評價靈芝孢子油保健功效的重要指標。靈芝三萜酸具有強烈的藥理活性，有護肝、解毒、殺滅癌細胞和止痛等功能。如靈芝酸具有抑制細胞組織胺的釋放、抑制血管緊張素酶的活性、抗病毒等功效[11-14]。目前測定靈芝孢子油中總三萜含量的方法尚未統(tǒng)一，測定方法大多采用香草醛乙酸溶液和高氯酸顯色比色法，但顯色條件各有不同，總三萜含量也無法真實比較[15-19]。本文通過5%香草醛-乙酸溶液和高氯酸顯色方法，分析各因素影響，建立了簡單、方便、準確、重復性好的靈芝孢子油總三萜含量測定的方法，以適用于靈芝孢子油中總三萜含量的對比分析。

1 材料與儀器

1.1 主要材料

靈芝孢子油：廣東現(xiàn)代漢方科技有限公司。

齊墩果酸對照品：中國食品檢定研究院；冰醋酸、香草醛、高氯酸、無水乙醇等（分析純）：廣州化學試劑廠。

1.2 主要儀器

UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9425A型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；FB15067型超聲波清洗器：Fisher Scientific飛世爾實驗器材（上海）有限公司。

2 試驗方法

2.1 試樣液制備

準確稱取靈芝孢子油樣品0.1 g于100 mL容量瓶中，加入無水乙醇80 mL，超聲提取1 h。冷卻至室溫20℃后，用無水乙醇定容至刻度線，搖勻，作為供試液。

2.2 標準儲備液的制備

稱取10 mg齊墩果酸對照品，置100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成約0.1 mg/mL的齊墩果酸對照品儲備液。

2.3 測定波長的選擇

取配置好的標準溶液0.6 mL于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸輕輕振蕩，于70℃水浴加熱15 min，取出冷卻加入5 mL乙酸后，在可見光區(qū)進行掃描，確定最大吸收波長540 nm。齊墩果酸標準溶液的吸收曲線掃描見圖1。

圖1 齊墩果酸標準溶液的光吸收曲線Fig.1 Ultaraviolet absorption speatrum of oleanolic acid

2.4 顯色水浴溫度的選擇

分別取0.8 mL標準儲備溶液加入到18個比色管中，按2.3方法操作，改變顯色溫度為40、50、60、70、80、90℃后，測定吸光度值，其結果見表1。

表1 不同水浴溫度對吸光度值的影響Table 1 Effect of different bath temperature on the absorbance value

由表1比較得知，顯色溫度在70℃時，試樣與顯色劑反應完全，顯色效果較佳，在80℃以后時雖然吸光度高，但空白吸光度值大，因此水浴溫度在70℃時最佳。

2.5 顯色的穩(wěn)定時間的選擇

分別取0.8 mL標準儲備溶液加入到18個比色管中，按2.3方法操作，改變顯色的穩(wěn)定時間為5、10、15、30、45、60 min后，測定其吸光度值，其結果見表2。

表2 不同穩(wěn)定時間對吸光度值的影響Table 2 Effect of different stabilizing time on absorbance value

續(xù)表2 不同穩(wěn)定時間對吸光度值的影響Continue table 2 Effect of different stabilizing time on absorption value

由表2比較得知，穩(wěn)定時間在15 min時，試樣顯色充分，隨著時間的增長，空白吸光度過大。因此選擇15 min為穩(wěn)定時間。

2.6 顯色劑用量的選擇

分別取0.8 mL標準儲備溶液加入到15個比色管中，按2.3方法操作，改變顯色的顯色劑用量為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL后，測定其吸光度值，其結果見表3。

表3 不同顯色劑用量對吸光度值的影響Table 3 Effect of different amount of colorant on the absorbance value

由表3比較得知，顯色劑用量在0.2 mL時，吸光度較大且平行性好，顯色劑用量在0.2 mL以后，空白吸光度過高，會對低濃度試樣結果產生影響，因此選擇0.2 mL為顯色劑用量。

2.7 高氯酸用量的選擇

分別取0.8 mL標準儲備溶液加入到18個比色管中，按2.3方法操作，改變高氯酸用量為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL后，測定其吸光度值，其結果見表4。

表4 不同高氯酸用量對吸光度值的影響Table 4 Effect of different amounts of perchloric acid on the absorbance value

由表4比較得知，穩(wěn)定劑在0.8 mL時，吸光度較大，顯色效果較好，選擇高氯酸用量為0.8 mL最佳。

2.8 標準曲線的制定

用建立的檢測方法按2.3方法測定齊墩果酸標準工作曲線，配置實際齊墩果酸標準溶液溶度為0.092 07 mg/mL，x軸選取齊墩果酸的絕對含量為0、0.018、0.037、0.055、0.074、0.092、0.110 mg，每點平行測定3次結果取平均值，分析結果見表5。以質量c為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，進行線性擬合，c與A之間呈線性關系。線性回歸方程和線性相關系數(shù)見表5，線性擬合曲線見圖2。該分析方法線性關系良好，可以進行定量分析。

2.9 專屬性

取8只具塞比色管標號1至8，以1、2號比色管作為空白試劑管，加入乙酸試劑；以3、4號比色管作為陰性樣試驗管，加入無水乙醇0.2 mL；以5、6號管作為陽性樣試驗管，在其中加入0.2 mL 2試樣液；以7、8號管作為陽性樣加標試樣管，在其中加入0.2 mL試樣夜和0.2 mL標準儲備液。分別將3～8號比色管按2.3進行處理，將1至8號比色管在540 nm處測定吸光值，結果見表6。

表5 齊墩果酸標準溶液的線性回歸方程和線性相關系數(shù)Table 5 Linear regression equation and linear correlation coefficient of the standard solution of oleanolic acid

圖2 齊墩果酸標準溶液線性擬合曲線Fig.2 Linear fitting curve of standard solution of oleanolic acid

表6 方法專屬性試驗Table 6 Method exclusive test

由表6分析得知，試驗方法在空白試劑條件下吸光度值為0，陰性樣和陽性樣的吸光度值結果差異明顯，且陽性樣加標試驗與陽性試驗有很顯著的吸光度值增加體現(xiàn)，結果表明分析方法具有良好的專屬性。

2.10 方法精密度

用建立的方法對同一批次的靈芝孢子油進行6次測定，其中樣品取樣量為0.1 g。計算6個測定結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表7。

表7 測定方法的重復性Table 7 Repetition of measurement methods

用建立的方法對同一批次的靈芝孢子油進行6次測定，其中樣品取樣量為0.1 g，分別在不同日期，不同人員，不同儀器的情況下分別測試2次，計算6個測定結果的相對標準偏差，結果見表8。

表8 測定方法的中間精密度Table 8 Intermediate precision of the determination method

從表7和表8得出：RSD值分別為1.5%和2.3%，符合一般方法的RSD＜5%的要求，該方法具有很好的精密度。

2.11 方法準確度

稱取樣品0.1g（精確到0.000 1 g），共稱取12個，每4個為1組一共3組，每組保留1個不加標，另外3個進行加標回收試驗。樣品稱取后，按試驗方法操作，于樣品中分別加入 28.25、28.77、28.79、35.20、35.18、35.26、53.65、54.21、55.15 mg 齊墩果酸對照品，按試驗方法處理進行比色測定，即進行3組不同濃度的加標回收試驗，具體試驗數(shù)據(jù)見表9。

表9 回收率試驗結果Table 9 Experimental results of recovery rates

從表9可知，此3組不同濃度的平均加標回收率分別為101.8%、99.9%、97.4%，滿足一般檢測方法對回收率90%～110%要求。

3 10批不同廠家靈芝孢子油樣品測定

分別購買10批不同廠家的靈芝孢子油，分別準確稱取0.10 g樣品于10 0 mL容量瓶中，加入無水乙醇80 mL，超聲提取1 h。冷卻至室溫20℃后，用無水乙醇定容至刻度線，搖勻，作為供試液。取0.2 mL供試液于具塞比色管，置于干燥箱內，90℃烘干溶劑。分別加入0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，輕輕振蕩，于70℃水浴加熱15 min，取出，立即置冰水冷卻5 min。用5 mL移液管準確移取冰乙酸5.0 mL稀釋，搖勻，在30 min內用紫外分光光度計在540 nm處測其吸光度A。通過線性回歸方程計算得到供試液中總三萜的含量見表10。

表10 市售10種靈芝孢子油中總三萜含量Table 10 Total triterpenes in 10 commercially available ganoderma spore oils

從表10中可以看出市售的10種靈芝孢子油都能滿足其標示值，其中產品2和產品6的總三萜實測值最高，達到34.2%，產品4的實測值最低，為23.7%。

4 結論

以香草醛乙酸溶液及高氯酸為顯色劑，并通過水浴加熱的條件，采用分光光度法是測定總三萜的常用方法，但其水浴時間、溫度、顯色劑用量和高氯酸用量都會影響所測總三萜含量。通過單因素逐步分析，總結出在加入0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，于70℃水浴加熱15 min的條件下，測試靈芝孢子油中總三萜的含量能夠達到精密度好，準確度高，對樣品空白影響較小，且方法有很好的回收率，能夠為不同靈芝孢子油中總三萜含量的對比提供較好的參考方法。