高效液相色譜法測(cè)定蔬菜和水果中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴

王鐘，何漪，王敏，邢燕，殷茂榮

（淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東淄博255026）

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是非常重要的一類持久性有機(jī)污染物（persistent organic pollutants，POPs），廣泛存在于自然界中。多環(huán)芳烴是由2個(gè)或2個(gè)以上的苯環(huán)以稠環(huán)或非稠環(huán)的形式相鏈接的性能穩(wěn)定的化合物，其中大部分化合物具有較強(qiáng)的致癌特性[1]。隨著所含苯環(huán)數(shù)的增加，多環(huán)芳烴的致癌特性明顯增強(qiáng)。目前關(guān)于多環(huán)芳烴的研究主要集中于美國(guó)環(huán)保署（U.S Environmental Protection A－gency，EPA）提出的16種優(yōu)先控制多環(huán)芳烴，而對(duì)于歐洲食品安全局2008年提出的15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴（European priority controlled polycyclic aromatic hydrocarbons，EU-PAHs）的報(bào)道較少。歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴中包括8種EPA優(yōu)控PAHs及其他8種新物質(zhì)，EU優(yōu)控新增了更多重質(zhì)多環(huán)芳烴，剔除了EPA優(yōu)控中的輕質(zhì)多環(huán)芳烴。目前，對(duì)于水[3]和土壤[4]中多環(huán)芳烴的研究較多，而鮮有對(duì)于蔬菜和水果中歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的研究。截至目前，我國(guó)尚未建立檢測(cè)蔬菜和水果的歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。由于蔬菜和水果中PAHs的種類復(fù)雜且含量較低，故選擇簡(jiǎn)單、快速的樣品前處理方法尤為重要。近年來(lái)，一些常用的前處理輔助技術(shù)[5]例如超聲波、加壓等與傳統(tǒng)前處理方法相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出了一些高效、經(jīng)濟(jì)的前處理技術(shù)。測(cè)定多環(huán)芳烴含量的方法主要有熒光分光光度法[6]、氣相色譜（gas chromatography-flame ionization detector，GCFID）法[7]、氣相色譜質(zhì)譜（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）法[8]及高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-10]等。本研究利用超聲波輔助乙腈提取，經(jīng)N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）和無(wú)水 MgSO4凈化，用高效液相色譜-熒光檢測(cè)（HPLC-FLD）法檢測(cè)蔬菜和水果中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴，取得了較好的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

1.1.1 儀器

Waters e2695液相色譜儀（帶熒光檢測(cè)器）、Waters PAH C18色譜柱（5.0 μm，4.6 mm×250 mm）：美國(guó)Waters公司；ST 16R型高速離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；KQ-250B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；OA-SYS型氮?dú)獯蹈蓛x：美國(guó)Organomation；SZ-1型快速混勻器：江蘇金壇實(shí)驗(yàn)儀器廠；Milli-Q型純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司。

1.1.2 色譜條件

色譜柱：WatersPAHC18（5.0μm，4.6mm×250mm）；柱溫：35.0℃；流動(dòng)相：乙腈＋水，梯度洗脫；柱流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣體積：20.0 μL。液相色譜梯度洗脫程序見(jiàn)表1，液相色譜檢測(cè)器條件見(jiàn)表2。

表1 液相色譜儀梯度洗脫程序Table 1 Gradient eluted program in HPLC

表2 液相色譜檢測(cè)器條件Table 2 The conditions of HPLC detector

1.2 試劑與材料

N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）：天津博納艾杰爾科技有限公司；無(wú)水MgSO4，純度98%：德國(guó)CNW科技公司；15種歐盟優(yōu)控PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：苯并（c）芴、苯并（a）蒽、屈、5-甲基-1，2-苯并菲、苯并（j）熒蒽、苯并（b）熒蒽、苯并（k）熒蒽、苯并（a）芘、二苯并（a，l）芘、二苯并（a，h）蒽、苯并（g，h，i）苝、茚并（1，2，3-cd）芘、二苯并（a，e）芘、二苯并（a，i）芘、二苯并（a，h）芘，濃度均為 10 μg/mL，-18℃下保存：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck公司。

多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)中間液1（100 ng/mL）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，-18℃下保存；多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)中間液2（20 ng/mL）：德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司，現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品：按照國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)計(jì)劃，隨機(jī)采集山東省17地市售蔬菜和水果各30份，共計(jì)60份。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品處理

稱取10.0 g粉碎后的蔬菜、水果樣品于50 mL具塞離心管中，加入20.0 mL乙腈，振搖1 min，超聲30 min，加入5.0 g氯化鈉，振搖1 min，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液10.0 mL，氮吹濃縮至2.0 mL，加入150 mg PSA和300 mg無(wú)水MgSO4，渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min，吸取上清，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，備用。吸取10 μL，進(jìn)樣分析。以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時(shí)間進(jìn)行定性，利用峰面積求出樣品溶液中待測(cè)物的濃度。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)中間液2（濃度為20ng/mL）0.025、0.050、0.25、0.50、1.00 mL，用乙腈定容至 1.0 mL，配制成濃度分別為 0.50、1.00、5.00、10.0、20.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將配制的系列標(biāo)準(zhǔn)液注入高效液相色譜分離。從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，以峰面積Y作因變量，分別以15種標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度x（ng/mL）作自變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品測(cè)定

在優(yōu)化的色譜條件下，吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品測(cè)試液各10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分離，進(jìn)樣分析。以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時(shí)間進(jìn)行定性，利用峰面積求出樣品溶液中待測(cè)物的濃度。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

式中：X為樣品中多環(huán)芳烴的含量，μg/kg；A1為樣品峰面積；C為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ng/mL；V為樣品定容體積，mL；A2為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積；m為樣品質(zhì)量，g。

1.4 試驗(yàn)條件優(yōu)化

1.4.1 萃取溶劑的選擇

由于蔬菜和水果的基體成分復(fù)雜，且多環(huán)芳烴（PAHs）的濃度水平較低，因此選擇適宜的萃取溶劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提。分別選擇正己烷、二氯甲烷和乙腈作為萃取劑，比較其對(duì)15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴（EU-PAHs）的回收率。

1.4.2 超聲提取時(shí)間優(yōu)化

稱取適量水果蔬菜樣品6份，加入多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)后的樣品中多環(huán)芳烴的濃度達(dá)5.0 μg/kg，冷凍保存24 h后，考察不同超聲時(shí)間對(duì)提取效率的影響，試驗(yàn)考察了在 10、20、30、45、60 min 的超聲提取效果，其回收率與提取時(shí)間的趨勢(shì)如圖1所示。

圖1 不同超聲提取時(shí)間平均回收率趨勢(shì)圖Fig.1 Trend chart of average recovery rate for different ultrasound extraction time

由圖1可以看出，超聲30 min～40 min平均回收率變化不大，故超聲時(shí)間選為30 min。

1.4.3 分離條件和檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化

多環(huán)芳烴組分的沸點(diǎn)較高，色譜柱選擇PAH C18（5.0 μm，4.6 mm×250 mm），分離效果良好。分別選取不同配比的水+乙腈作為流動(dòng)相，從保留時(shí)間、分離效果、峰形等進(jìn)行比較，確定梯度洗脫分析條件。利用紫外檢測(cè)器對(duì)紫外波長(zhǎng)掃描鑒定，利用熒光檢測(cè)器掃描確定靈敏熒光波長(zhǎng)；最終確定色譜條件，另外，對(duì)流動(dòng)相流速、色譜柱溫度等進(jìn)行選擇并優(yōu)化，15種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)的分離效果如圖2所示，該色譜條件下，15種物質(zhì)均能達(dá)到基線分離。

圖2 15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴色譜圖Fig.2 Chromatographic charts of 15 EU-PAHs

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑的選擇

通過(guò)比較，乙腈作為提取溶劑時(shí)可獲得較高的回收率，15種PAHs的平均回收率可達(dá)90.0%。而正己烷和二氯甲烷做為萃取溶劑時(shí)，平均回收率分別為67.2%和81.4%。考慮到本方法以乙腈和水為流動(dòng)相，在提取過(guò)程中選擇乙腈作為提取溶劑，無(wú)需溶劑置換，避免了因置換溶劑而造成組分的損失。因此本試驗(yàn)選擇乙腈做為萃取溶劑。

2.2 方法的線性范圍、檢出限、回收率和精密度

用乙腈為溶劑，配制多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度均為0.50 ng/mL～20.0 ng/mL。在試驗(yàn)條件下分離檢測(cè)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定2次，以標(biāo)準(zhǔn)的峰面積對(duì)濃度作曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

分別精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00、20.0 ng/mL，加入到已得到濃度的樣品溶液中，使加入后待測(cè)物含量分別為1.0 μg/kg和5.0 μg/kg，按上述色譜條件進(jìn)行分析，每個(gè)樣品平行進(jìn)樣6次測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。在不同的加標(biāo)濃度下，加標(biāo)回收率在83.6%～97.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）4.2%～12.0%之間。方法的回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方法的回收率、精密度、線性范圍和檢出限Table 3 Recovery，precision，linear range and detection limit of the method

由表3可見(jiàn)，15種多環(huán)芳烴在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999以上。方法的最低檢出濃度檢出限（detection limit，LOD）以3倍信噪比計(jì)算，檢出限為0.07 μg/kg～0.10 μg/kg。（按取樣10.0 g計(jì)算）。

2.3 蔬菜水果中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴濃度水平的檢測(cè)

為了解市售水果和蔬菜中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴污染水平。按照全省食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)計(jì)劃，采集全省17地市市售蔬菜和水果各30份，用本方法分析了蔬菜和水果中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的濃度水平。通過(guò)分析，15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴檢出8種，其中屈檢出率最高，共有40份樣品檢出，濃度范圍為0.10 μg/kg～0.81 μg/kg。60份蔬菜水果中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的檢出情況見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，蔬菜水果中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴以屈、苯并（c）芴、苯并（a）蒽及苯并（g，h，i）苝等 8種多環(huán)芳烴檢出率較高，其中屈的檢出率最高，濃度最大達(dá) 0.81 μg/kg。

圖3 蔬菜和水果中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的檢出情況Fig.3 Detection of 15 EU-PAHs in vegetables and fruits

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助乙腈提取，PSA和無(wú)水MgSO4凈化，高效液相色譜儀分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)法測(cè)定蔬菜和水果15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴。該方法操作簡(jiǎn)單，試劑消耗量少，且該方法檢測(cè)效率高，方法檢測(cè)線性范圍寬，準(zhǔn)確度、靈敏度高及檢出限低，適用于蔬菜和水果中15種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的檢測(cè)。