響應面優化小麥淀粉抗老化酶解工藝

王柱，史騰軒，王思宇，亓鑫，董墨思，冀迎昕，劉垚彤，李蘇紅

（沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110866）

世界上每年都會出現因為淀粉老化而浪費大量糧食的現象，因此研究淀粉老化問題顯得尤為迫切[1-2]。淀粉老化是其線性分子通過氫鍵重新組合生成不溶的沉淀物[3]。目前抑制淀粉老化多采用添加糖類[4-5]、乳化劑[6-7]、親水膠體[8-9]及酶水解法[10-11]來減緩淀粉老化問題，其中酶解作用效果顯著且綠色無污染，備受淀粉抗老化研究者的關注。姬娜等[12]發現G4淀粉酶能作用于淀粉支鏈產生四糖，以此降低支鏈淀粉側鏈的長度延緩老化；孫玲玲等[13]、邱潑等[14]采用β-淀粉酶對糯米回生、米粉老化現象進行研究，β-淀粉酶作為一種端切酶，從淀粉分子的非還原末端依次切下麥芽糖分子，從而縮短支鏈淀粉的外鏈長度抑制淀粉回生；此外，王辛等[15]利用α-淀粉對傳統糕團類淀粉老化進行研究。本研究擬通過凍融穩定性、膨脹度和溶解度比較分析β-淀粉酶和G4淀粉酶對小麥淀粉老化特性影響的差異及二者之間是否存在協同作用，結果表明兩者都對淀粉老化有一定的抑制作用，但兩者對淀粉老化的影響無顯著差異，且兩者的協同效果不顯著。從實際生產的角度選擇價格低廉的β-淀粉酶酶解小麥淀粉的條件進行響應面法優化，以期為酶解法在淀粉抗老化領域的應用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥淀粉：南京甘汁園糖業有限公司；β-淀粉酶（70萬U/mL）：浙江仁和生物科技有限公司；G4淀粉酶（20萬U/mL）：河南慶飛食品配料有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9070S電熱鼓風干燥機：寧波樂電儀器制造有限公司；JD100-4電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；TDL-5離心機：上海安亭科學儀器有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

稱取80 g小麥淀粉，與220 mL蒸餾水在燒杯中用玻璃棒攪均，放入58℃的水浴鍋糊化20 min，冷卻至室溫25℃，向其中加入淀粉酶，放在40℃的水浴鍋水浴30 min，不停地攪拌使酶充分反應，反應完全后在100℃下滅酶2.5 min，溫度降至室溫25℃。將樣品倒入500 mL離心瓶，于3 000 r/min離心20 min[16]，取下層濕淀粉勻稱地涂抹在錫紙上，然后將涂有樣品的錫紙置于60℃干燥箱干燥12 h，將干燥后的樣品與錫紙分離，研磨，制備得到樣品。

1.3.2 凍融穩定性測定

小麥淀粉與蒸餾水混合配成濃度6%的乳液，100℃水浴20 min，溫度降至室溫25℃；將小麥淀粉放入容量10 mL的離心管中，放于-18℃冷凍24 h，然后室溫25℃下融化8 h。于3 000 r/min離心20 min，將上清液與沉淀物分離，計算沉淀物的重量，計算析水率。平行測定3次。析水率計算公式如下：

式中：D 為析水率，%；A1為淀粉糊質量，g；A2為沉淀物質量，g。

1.3.3 溶解度、膨脹度測定

將小麥淀粉與蒸餾水混合配成濃度6%的乳液，于85℃水浴鍋中反應30 min，然后于3 000 r/min的條件下離心20 min，膨脹淀粉為淀粉糊的下部，隨即將上層的清澈的液體與淀粉糊分離開來，然后干燥，便得到水溶淀粉，然后利用水溶液淀粉的質量計算出溶解度。溶解度、膨脹度計算公式如下：

式中：S為溶解度，%；E為膨脹度，%；A1為水溶淀粉質量，g；A2為淀粉樣品質量，g；A3為膨脹淀粉質量，g。

1.4 單因素試驗

1.4.1 酶解時間對小麥淀粉抗老化的影響

按1.3.1的方法對小麥淀粉進行糊化，然后加入0.2%的淀粉酶，分別在 60 ℃水解 5、15、25、35、45、55 min后，沸水浴滅酶2.5 min。離心20 min、干燥后測定樣品的凍融穩定性、溶解度和膨脹度的變化。

1.4.2 酶解溫度對小麥淀粉抗老化的影響

按上1.3.1的方法對小麥淀粉進行糊化，然后加入0.2%的淀粉酶，分別在 40、45、50、55、60、65 ℃ 酶解30 min后，沸水浴滅酶2.5 min。離心20 min、干燥后測定樣品的凍融穩定性、溶解度和膨脹度的變化。

1.4.3 加酶量對小麥淀粉抗老化的影響

按1.3.1的方法對小麥淀粉進行糊化，然后分別加入0.05%、0.10%、0.20%、0.25%、0.30%的淀粉酶，60℃水解30 min。離心20 min、干燥后測定樣品的凍融穩定性、溶解度和膨脹度的變化。

1.5 復配試驗

稱取80 g小麥淀粉，與220 mL蒸餾水在燒杯中用玻璃棒攪均，放入58℃的水浴鍋糊化20 min，冷卻至室溫25℃。然后向其中加淀粉酶，ck1為只添加了0.15%的β-淀粉酶，ck2為只添加了0.2%的G4淀粉酶，其他組是在添加了0.15%β-淀粉酶的基礎上分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%的 G4淀粉酶，放在60℃水浴鍋反應35 min，樣品處理方式同1.3.1。

1.6 響應面優化酶解淀粉抗老化工藝

使用Design-Expert 8.0軟件，采用Box-Behnken設計，自變量分別是加酶量、時間、酶解溫度，A、B、C分別表示加酶量、時間、酶解溫度，自變量的高、中、低水平分別用1、0、-1表示，分別以小麥淀粉的析水率、溶解度和膨脹度為響應值，進行響應面試驗。試驗因素與因素水平見表1。

表1 試驗因素與因素水平Table 1 Experimental factors and factors level

1.7 數據處理

數據處理采用Microsoft Excel 2013，顯著性分析采用SPSS16.0，響應面優化采用Design Expert8.0。

2 結果與分析

2.1 酶解時間對小麥淀粉抗老化的影響

淀粉顆粒吸水膨脹，溶解度和膨脹度的升高，氫鍵強度減弱，抑制分子之間相互吸引，延緩淀粉重結晶。析水率能夠反映淀粉的凍融穩定性，凍融后析水率越低說明抑制淀粉老化的效果越明顯。G4淀粉酶和β-淀粉酶處理小麥淀粉隨時間的變化如圖1。

圖1 酶解時間對小麥淀粉抗老化的影響Fig.1 The effect of enzymatic hydrolysis time on the inhibiting retrogradation of wheat starch

G4淀粉酶在酶解時間為45 min時，溶解度和膨脹度最高分別為16.2%和64.4%，而析水率最低為55.7%。β-淀粉酶在酶解時間為35 min時，溶解度和最高分別為16.1%，而析水率最低55%。酶解時間在35 min～45 min以前，隨著酶解時間的增加，淀粉的溶解度和膨脹度增加，析水率下降。一旦酶解時間超過35 min～45min時隨著時間的繼續增加淀粉的溶解度和膨脹度都有明顯的下降趨勢，而析水率升高。β-淀粉酶在55 min時的析水率略低于45 min，但仍高于35 min時。這是因為隨時間的延長，酶對淀粉老化的抑制效果趨于完全，抑制淀粉老化的效果不明顯[17]。

通過對比可知，G4淀粉酶處理后的小麥淀粉的溶解度和膨脹度比原小麥淀粉分別上升了9.45%和22.2%，析水率下降了12.7%。β-淀粉酶處理后的小麥淀粉的溶解度和膨脹度比原小麥淀粉分別上升了9.3%和30.5%，析水率下降了13.4%。與空白組比較，結果進行顯著性分析，酶解時間對小麥淀粉的抗老化效果具有極顯著影響（P＜0.01），且兩種酶的作用效果無顯著差異段，從單因素的試驗結果來看，在酶解時間25 min～35 min時，兩種酶的抗老化效果趨勢最好，一旦超過這一時間抗老化的效果變差，因此選擇30 min作為最優條件。

2.2 酶解溫度對小麥淀粉抗老化的影響

酶解溫度對小麥淀粉抗老化的影響見圖2。

圖2 酶解溫度對小麥淀粉抗老化的影響Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on inhibiting retrogradation of wheat starch

由圖2可知，酶解溫度逐漸達到淀粉酶作用效果最佳時的溫度，此時淀粉抗老化效果最好，淀粉的溶解度和膨脹度都達到頂峰，析水率達到最低值。G4淀粉酶在酶解溫度60℃時，溶解度和膨脹度最高分別為14.2%和64.4%，而析水率最低為50%。β-淀粉酶在酶解溫度為55℃時，溶解度和膨脹度最高分別為13.25%和53.3%，而析水率最低為45.1%。但超過50℃，酶的活力降低或部分喪失，淀粉的溶解度和膨脹度下降，析水率升高。

通過對比可知G4淀粉酶處理后的小麥淀粉的溶解度和膨脹度比原小麥淀粉分別上升了7.4%和22.2%，析水率下降了18.4%。β-淀粉酶處理后的小麥淀粉的溶解度和膨脹度比原小麥淀粉分別上升了6.4%和11.1%，析水率下降了23.3%。結果進行顯著性分析，酶解溫度對小麥淀粉的抗老化效果具有極顯著影響（P＜0.01），且兩種酶的作用效果無顯著差異。酶解溫度在50℃～55℃時，淀粉酶抗老化效果最優，一旦超過這一溫度抗老化效果變差，因此選擇52.5℃作為最優條件。

2.3 加酶量對小麥淀粉抗老化的影響

加酶量對小麥淀粉抗老化的影響見圖3。

圖3 加酶量對小麥淀粉抗老化的影響Fig.3 The effect of enzyme dosage on inhibiting retrogradation of wheat starch

圖3表明，G4淀粉酶在加酶量為0.2%時，β-淀粉酶在添加量為0.15%時，溶解度和膨脹度最高均為12.7%和53.3%，且析水率最低。經過G4淀粉酶酶解后小麥淀粉的析水率降到37.9%，其結果與姬娜等[12]的研究結果一致。β-淀粉酶處理的析水率則為57.4%。伴隨著加酶量的逐漸增多，酶解程度增大達到頂峰，之后趨于水平。加酶量在0.1%～0.15%時，抗老化效果最好，一旦超過這一添加量抗老化效果變差，因此選擇加酶量為0.13%作為最優條件。

通過對比可知G4淀粉酶和β-淀粉酶處理后的小麥淀粉的溶解度和膨脹度都比原小麥淀粉分別上升5.9%和11.1%。G4淀粉酶處理的析水率下降了30.5%，β-淀粉酶處理的析水率下降了11%。結果進行顯著性分析，加酶量對小麥淀粉的抗老化效果具有極顯著影響（P＜0.01），且兩種酶的作用效果無顯著差異。

2.4 復配試驗的方差分析

G4淀粉酶與β-淀粉酶復配試驗的顯著性分析結果見圖4。

圖4 G4淀粉酶與β-淀粉酶復配Fig.4 Complex of G4 amylase and β-amylase

將其他試驗組、ck2組與ck1組進行顯著性分析，只有析水率一個指標顯著，且兩者復配作用的效果不顯著，從實際生產的角度，選擇價格低廉的β-淀粉酶進行響應面優化試驗。

2.5 響應面優化

由單因素試驗結果分析可知影響小麥淀粉酶解的因素主要有3個：加酶量、酶解時間、酶解溫度，試驗采用三因素三水平響應面法優化β-淀粉酶酶解小麥淀粉工藝參數，試驗設計與結果如表2所示。

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Experimental scheme and results of response surface

析水率結果的方差分析：使用二次模型擬合各因素與析水率的關系，模型的P＜0.000 1，說明這個試驗模型極顯著。失擬項P=0.071 0＞0.05，表明結果不顯著，但是該方程對試驗的擬合程度好，該試驗方案可行。析水率受因素 A2、B2、C2的作用極明顯（P＜0.01）。析水率受因素AB、BC、AC的交互作用后的結果不明顯。根據一次回歸方程系數的絕對值比較可得，對析水率影響因素的主次為：酶解時間＞加酶量＞酶解溫度，回歸方程見表3。

溶解度結果的方差分析：使用二次模型擬合各因素與溶解度的關系，模型的P＜0.001，證明這個試驗模型極顯著。失擬項P=0.584 1＞0.05，不顯著，表明該方程對試驗的擬合度好，該方案可行。溶解度受因素A2、C2的作用均極明顯（P＜0.01）；溶解度受B2的作用明顯（P＜0.05）。溶解度受因素AB、BC、AC交互作用后的結果不明顯。根據一次回歸方程系數的絕對值比較可得，影響溶解度因素的主次為：酶解時間＞加酶量＞酶解溫度，回歸方程見表3。

膨脹度結果的方差分析：使用二次模型擬合各因素與膨脹度的關系，模型的P＜0.05，說明這個試驗模型顯著。失擬項P=0.058 5＞0.05，不顯著，說明該方程對試驗的擬合度好，該方案可行。因素A2、B2對膨脹度的作用明顯（P＜0.05）；C2對膨脹度的作用不明顯。膨脹度受因素AB、BC、AC交互作用后的結果不顯著。根據一次回歸方程系數的絕對值比較可得，影響膨脹度因素的主次為：酶解時間＞加酶量＞酶解溫度，回歸方程見表3。

表3 響應值對因素的回歸方程Table 3 Regression equation of response value pairs

2.5.1 各因素交互作用對析水率的影響

各因素交互作用對析水率的影響見圖5。

由圖5a可知，酶解時間和加酶量的逐漸增加，小麥淀粉的析水率先降低后升高，等高線的形狀趨近于圓形，析水率受時間和加酶量的交互作用后變化不明顯。由圖5b可知，加酶量和溫度的逐漸升高，析水率先降低然后有明顯的增加，等高線的形狀為橢圓形，這表明析水率受加酶量和溫度的作用顯著，由此可見，選擇合適的加酶量和溫度有利于淀粉的抗老化。同理，由圖5c可知，析水率受酶解時間與溫度的交互效應后效果顯著。

圖5 各因素交互作用對析水率的影響Fig.5 Influence of each factor interaction on the syneresis rate

2.5.2 各因素交互作用對膨脹度的影響

各因素交互作用對膨脹度的影響見圖6。

圖6 各因素交互作用對膨脹度的影響Fig.6 Influence of each factor interaction on the expansion degree

由圖6a可知，酶解時間和加酶量的逐漸增加，小麥淀粉的膨脹度先急速升高再勻速下降，等高線的形狀趨近于橢圓形，膨脹度受時間和加酶量的交互效應后變化顯著。由圖6b可知，加酶量和溫度的逐漸升高，膨脹度先急速上升再緩慢下降，等高線的形狀為橢圓形，說明膨脹度受加酶量和溫度交互效應后的變化極顯著。由圖6c可知，酶解溫度和時間的逐漸延長，膨脹度勻速上升然后勻速下降，說明膨脹度受酶解溫度和時間的交互效應后的變化極顯著。

2.5.3 各因素交互作用對溶解度的影響

各因素交互作用對溶解度的影響見圖7。

圖7 各因素交互作用對溶解度的影響Fig.7 Influence of each factor interaction on the solubility

由圖7a可知，隨酶解時間和加酶量的逐漸增加，小麥淀粉的溶解度先上升然后緩慢的下降，等高線的形狀趨近于橢圓形，說明溶解度受時間和加酶量的交互效應后的變化顯著。由圖7b可知，加酶量和溫度的逐漸升高，溶解度急速上升然后下降，等高線的形狀為橢圓形，說明溶解度受加酶量和溫度的交互效應后的變化顯著。同理，由圖7c可知，酶解時間和溫度的作用也顯著。

2.6 優化及驗證試驗

用Design Expert 8.0軟件進行響應面優化，得到小麥淀粉酶解的最優工藝條件是：加酶量0.13%、酶解時間31.59 min、溫度52.84℃，在此條件下，小麥淀粉的析水率35.83%、膨脹度66.66%、溶解度17.31%。考慮到實際生產，小麥淀粉酶解的最優工藝條件調整為：加酶量0.13%、酶解溫度52.5℃、酶解時間30 min，在這個條件下，小麥淀粉的析水率、膨脹度和溶解度分別為35.8%、66.65%、17.34%，與預測值相近，由此表明該模型可靠。

3 結論

本研究比較分析了β-淀粉酶、G4淀粉酶的酶解作用對小麥淀粉抗老化的影響，兩種酶對小麥淀粉的抗老化指標析水率、溶解度和膨脹度的影響均具有顯著性，能夠顯著提高淀粉的抗老化效果，兩者的作用效果相近無顯著差異，且復配后協同效果不顯著。選用具有價格優勢的β-淀粉酶得到小麥淀粉酶解的優化工藝條件是：加酶量0.13%、酶解溫度52.5℃、酶解時間30 min，在此條件下，小麥淀粉的析水率、膨脹度和溶解度分別為35.80%、66.65%、17.34%，顯著改善了小麥淀粉的凍融穩定性及膨潤性，延緩其老化進程。