羥氯喹逆轉慢性髓性白血病細胞K562/IMA對伊馬替尼耐藥的作用機制研究

楊毅 李文燕 盛泳佳 王瑾 陳啟緒 韓晨陽

慢性髓性白血病（CML）是造血干細胞異常轉化而產生的一種髓系惡性克隆白血病，遺傳學特征表現為t（9；22）（q34；q11）易位，產生BCR-ABL融合基因，該融合基因翻譯的蛋白屬于非受體酪氨酸激酶，其二聚體形式可以導致底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化，激活多條信息傳遞途徑，干擾細胞的基本活動[1-2]。目前臨床治療CML的方法包括以羥基脲為主要藥物的化療、INF-α以及異基因造血干細胞移植等[3-4]。伊馬替尼（IMA）作為選擇性的酪氨酸激酶抑制劑，是CML首選靶向治療藥物，對初發慢性期CML患者可達到完全細胞遺傳學反應（CCR），1 年無病生存率可達到 100%[5-6]。然而，IMA的耐藥現象在臨床中也并不鮮見。研究發現，IMA的耐藥過程牽涉多種機制，α-1酸性糖蛋白AGP的產生、耐藥基因MDR-1的過度表達、BCR-ABL基因擴增或突變是耐藥產生的主要原因[7]。因此，如何治療IMA耐藥的CML是當前臨床研究的熱點。

近年研究發現，細胞自噬性耐藥或是耐藥產生的一大機制。鉑類藥物、烷化劑等耐藥與細胞自噬的誘導有關，CML化療常用藥物紫杉醇可以通過細胞自噬激活產生耐藥[8]。而臨床應對此種耐藥常常會聯合使用自噬抑制劑。研究發現，紫杉醇耐藥的CML細胞K562采用羥氯喹預處理，可以顯著提高細胞的藥物敏感性，機制在于羥氯喹抑制酸性囊泡的產生，間接抑制細胞自噬的發生[9-10]。基于此，本研究將細胞自噬抑制劑羥氯喹聯合伊馬替尼作用于CML K562/IMA細胞株，觀察其對該細胞株耐藥的影響，并探討其作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 CML K562/IMA細胞株（嘉興市第二醫院實驗室自備，對10μmol/L的IMA耐藥），IMA和羥氯喹標準品（北京中科質檢生物技術有限公司，批號7330441、100582），CCK-8檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號 C0037），Transwell小室（康寧公司），Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（美國BD公司），單丹磺酰尸胺（MDC）染色試劑盒（北京雷根生物技術有限公司，批號25875），免疫熒光染色試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號 P0179），LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、Beclin-1 以及Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 的單克隆抗體（Cell Signaling Technology公司，批號4108、39749、3495、2772、3498、9662、9502）。電子分析天平（梅特勒-托里多儀器有限公司，型號ME204E），DP11顯微鏡（日本奧林巴斯公司），PCR儀（型號 BS97MyCycler），Western blot電泳儀（型號1658001），FACS CantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 K562/IMA細胞株復蘇后，采用RPMI 1640完全培養基+10%FBS培養，待細胞生長至對數期后，將細胞分為對照組（Con組）、IMA干預組（IMA組）、羥氯喹+IMA干預組（HCQ+IMA組）。Con組為常規培養的細胞，無藥物干預；IMA組采用含10μmol/L IMA的培養基培養；HCQ+IMA組采用含10μmol/L羥氯喹的培養基培養（預處理）12h后，再用含10μmol/L IMA的培養基培養。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖率 將對數生長期的K562/IMA細胞接種到96孔板中，IMA組和HCQ+IMA組采用含10μmol/L IMA的培養基培養。設置時間點為0、6、12、18、24、30、36h，待培養完成后加入 10μl的CCK-8溶液，繼續培養4h，用酶標儀在480nm處檢測吸光度（A值）。細胞增殖率（%）=[A（加藥）-A（空白）] /[A（對照）-A（空白）] ×100%

1.2.3 Annexin V-FITC/PI染色后流式細胞術檢測細胞凋亡率 將對數生長期的K562/IMA細胞接種到6孔板中，IMA組和HCQ+IMA組采用濃度為10μmol/L的IMA干預，加藥后培養24h，收集細胞后加入Binding Buffer重懸。而后加入Annexin V-FITC液10μl混勻，避光反應10min，再加入10μl的 PI染色避光反應10min，PBS洗去多余染色液后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 將對數生長期的K562/IMA細胞加入Transwell小室，IMA組和HCQ+IMA組采用含10μmol/L IMA的培養基培養，培養基中不加FBS，而24孔板下室加入完全培養基，培養基含10%的FBS，待培養24h后取出小室，棄去培養基，甲醇固定后用0.1%的結晶紫染色，棉簽擦去上層未遷移的細胞后鏡下觀察。

1.2.5 免疫熒光染色檢測細胞自噬激活標志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表達 將對數生長期的K562/IMA細胞接種到6孔板中，IMA組和HCQ+IMA組采用含10μmol/L IMA的培養基培養，將細胞培養基棄去，用甲醇固定后自然干燥，PBS洗3次，1%的Triton液處理30min，羊血清處理 30min，LC3Ⅰ/Ⅱ一抗（1∶500）稀釋后在 4℃下孵育過夜，次日用PBS洗凈一抗，二抗標記后晾干封片；使用熒光分光光度計檢測熒光強度。

1.2.6 MDC染色檢測細胞酸性囊泡 將對數生長期的K562/IMA細胞接種到6孔板中，IMA組和HCQ+IMA組采用含10μmol/L IMA的培養基培養6h后棄去培養基，用去離子水稀釋漂洗液 Wash Buffer（1∶1 稀釋），細胞用稀釋后的Wash Buffer重懸后調整細胞濃度為106/ml，加入MDC染色液染色后室溫避光染色30min，染色后用Wash Buffer清洗，滴加細胞液在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察，激發波長為355nm，阻斷波長為512nm，計染色陽性（黃綠色）細胞數。

1.2.7 Western blot法檢測細胞自噬相關蛋白p62、Beclin-1 及凋亡相關蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表達 將對數生長期的K562/IMA細胞接種到6孔板中，IMA組和HCQ+IMA組采用含10μmol/L IMA的培養基培養24h后收集各組細胞。PBS洗2次后，在冰上加入NP-40裂解液100μl裂解30min，3 000r/min離心后收集上清液；BCA法進行蛋白定量后調整蛋白濃度，根據蛋白分子量分別配置8%～12%的SDS-PAGE凝膠，取蛋白液用5×上樣緩沖液Loading Buffer補充體積至20μl，煮沸8min后進行電泳，電壓80V，之后轉換為120V，將凝膠去除后進行PVDF膜的轉膜；采用300mA恒流轉膜0.5～2h，PVDF膜使用5%脫脂奶粉封閉2h；TBST稀釋一抗，一抗孵育后PVDF膜用TBST洗2次再用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育。孵育完成后用化學發光法檢測，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進行光密度分析，以GAPDH為內參，結果以目的蛋白與內參蛋白光密度值比表示。

1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組細胞增殖率比較 見圖1。

圖1 3組細胞增殖率比較（與Con組比較，*P＜0.05；與IMA組比較，△P＜0.05）

由圖 1 可見，培養 6、12、18、24、30、36h 時，3 組細胞增殖率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），且HCQ+IMA組＜IMA組＜Con組（均P＜0.05）。Con組細胞0～36h時間段內呈增殖狀態，隨著時間的延長，細胞增殖率增高；IMA組細胞隨著時間的延長，細胞增殖率無明顯變化，說明細胞生長受到抑制；HCQ+IMA組細胞隨著時間的延長，細胞增殖率出現負增長，且細胞活力逐漸降低。這說明，羥氯喹預處理后，IMA可以明顯抑制K562/IMA細胞的增殖。

2.2 3組細胞凋亡率比較 見圖2。

圖2 3組細胞流式細胞圖比較

由圖2可見，Con、IMA、HCQ+IMA組細胞凋亡率分別為（0.98±0.22）%、（15.35±2.14）%、（38.65±5.32）%，3 組細胞凋亡率比較差異有統計學意義（P＜0.05），且HCQ+IMA組＞IMA組＞Con組（均P＜0.05）。

2.3 3組細胞侵襲能力比較 見圖3。

由圖3可見，Con、IMA、HCQ+IMA組細胞遷移數目分別為（59.32±8.32）、（63.22±7.52）、（25.32±5.32）個/視野，3組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；兩兩比較，HCQ+IMA組＜Con組（P＜0.05），HCQ+IMA組＜IMA組（P＜0.05），Con組與IMA組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。即HCQ+IMA組細胞侵襲能力低于Con、IMA組。

2.4 3組細胞自噬激活標志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表達情況比較 見圖4。

由圖4可見，Con組細胞LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白為陰性表達，細胞中幾乎無LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達，說明細胞自噬未激活；IMA組細胞LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白熒光強度明顯高于Con組；而HCQ/IMA組細胞與IMA組比較，LC3蛋白熒光強度明顯降低，說明細胞自噬受到了抑制。

圖3 Transwell小室檢測3組細胞侵襲能力顯微鏡下所見（結晶紫染色，×200）

圖4 3組細胞自噬激活標志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表達情況比較（免疫熒光染色，×400）

2.5 3組細胞酸性囊泡染色陽性細胞數比較 見圖5。

圖5 3組細胞酸性囊泡染色陽性細胞數比較（MDC染色，×200）

由圖5可見，Con、IMA、HCQ+IMA組酸性囊泡染色陽性細胞數分別為（16.36±2.56）、（56.35±6.68）、（35.65±3.25）個/視野，3組比較差異有統計學意義（P＜0.05），且IMA組＞HCQ+IMA組＞Con組（均P＜0.05）。即羥氯喹干預后可以減少細胞中酸性囊泡的形成。

2.6 3組細胞自噬相關蛋白p62、Beclin-1及凋亡相關蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 表達情況比較見圖6-7。

圖6 3組細胞自噬相關蛋白p62、Beclin-1表達情況比較（與Con組比較，*P＜0.05；與IMA組比較，△P＜0.05）

圖7 3組細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達情況比較（與Con組比較，*P＜0.05；與IMA組比較，△P＜0.05）

由圖6可見，3組細胞自噬相關蛋白p62、Beclin-1表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。細胞自噬底物蛋白p62表達水平兩兩比較，Con組（0.80±0.11）＞HCQ+IMA 組（0.35±0.05）＞IMA 組（0.12±0.11）（均P＜0.05）；自噬啟動調節蛋白Beclin-1表達水平兩兩比較，IMA 組（0.62±0.08）＞Con組（0.42±0.10）、HCQ+IMA 組（0.40±0.03）（均 P＜0.05），而 Con 組與HCQ+IMA組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。由圖7可見，3 組細胞凋亡相關蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。凋亡蛋白 Bax、Caspase-3、Caspase-9 表達水平兩兩比較，Con 組（0.32±0.05、0.20±0.03、0.15±0.03）＜IMA組（0.52±0.06、0.32±0.05、0.26±0.03）＜HCQ+IMA 組（1.15±0.13、0.45±0.06、0.42±0.03）（均 P＜0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平兩兩比較，Con組（0.50±0.05）＞IMA 組（0.13±0.02）＞HCQ+IMA 組（0.06±0.01）（均 P＜0.05）。

3 討論

20世紀90年代問世的IMA是一種選擇性的酪氨酸激酶抑制劑，大量的臨床試驗已經證明，400mg/d劑量的IMA長期服用可以使得80%以上的初發期CML患者達到CCR，而急性期的患者可以到34%以上，是一種治療CML的有效藥物。但是長期使用IMA，部分患者會出現耐藥，這種耐藥主要指慢性期患者未出現完全血液學反應或者加速期和急變期患者未有效達到慢性期[11]。對于IMA的耐藥，目前臨床應對方法十分有限，加大IMA劑量是常用的方法。有研究發現，IMA劑量增加到600mg/d或800mg/d對30%～50%繼發性耐藥患者有效，但是持續時間較短，且往往還會增加不良反應的發生[12-13]，所以該方法的可行性還有待進一步研究。也有研究發現，對于IMA耐藥可以采用與信號傳導通路的抑制劑聯用，比如Ras途徑抑制劑、PI3K途徑抑制劑等[14]，但是該類藥物聯合使用的作用機制未明，臨床推廣需要進一步深入的研究。

細胞自噬是細胞適應性生長、分化、凋亡所必須的一種生理現象。在腫瘤組織中，細胞自噬起到雙重作用，一方面細胞自噬可以保護正常細胞，抑制腫瘤細胞的生長，另一方面可以抵制外界環境對于腫瘤細胞的損傷，進一步促進腫瘤細胞的生長。近年研究發現，在腫瘤耐藥中，細胞自噬起了關鍵的作用[15-16]。MYC抑制劑預處理人前列腺上皮細胞后，對雷帕霉素不敏感，細胞自噬水平降低[17]。急性淋巴細胞白血病細胞會通過自噬對糖皮質激素產生耐藥[18]。而細胞自噬的產生和用藥劑量及用藥時長有關。有研究發現，小劑量的抗腫瘤藥物使用可以使腫瘤細胞迅速啟動自噬，細胞通過自噬清除損傷的細胞器等，從而獲得更好的抗性[19]。

筆者團隊在前期研究中發現，抑制Beclin-1基因的表達可以提高K562/IMA細胞對于IMA的敏感性[20]。這提示，細胞自噬的激活在K562細胞對IMA耐藥中起一定的作用。羥氯喹是一種臨床常用的類風濕性關節炎治療藥物。本研究結果顯示，羥氯喹可以抑制K562/IMA細胞自噬過程中酸性囊泡的產生，抑制自噬流的傳遞。本研究將羥氯喹聯合IMA作用于K562/IMA細胞，結果發現，羥氯喹預處理后可以顯著提高細胞對于IMA的敏感性，細胞凋亡率增高，同時增殖率下降，相比單用IMA具有明顯差異。IMA處理K562/IMA細胞可以提高LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達。LC3Ⅰ/Ⅱ是自噬激活的標志蛋白，用于自噬體的形成，而使用羥氯喹預處理后，LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達明顯受抑制。p62是自噬底物蛋白，在自噬發生后表達降低，而羥氯喹預處理后可以提高K562/IMA細胞p62表達水平；同時，細胞凋亡相關蛋白表達水平提高。這可以說明，K562/IMA細胞啟動了凋亡程序，IMA在耐藥株中重新獲得了細胞殺傷的能力。

綜上所述，本研究結果顯示，羥氯喹可以逆轉IMA耐藥的CML K562細胞對IMA的敏感性，其作用機制或與抑制細胞自噬有關。