miRNA-223靶向FoxO3抑制肺結核大鼠巨噬細胞凋亡研究

洪愛玲 朱海燕 何貴清 蘇菲菲

結核病是由結核分枝桿菌引起的一類嚴重危害人類健康的傳染性疾病。結核分枝桿菌是一種兼性巨噬細胞寄生菌[1-2]，感染人體后首先寄生在巨噬細胞內。巨噬細胞凋亡后，連細胞內的結核分枝桿菌一起被清除[3]。而后，凋亡的巨噬細胞激活臨近的未被寄生的巨噬細胞，增強機體巨噬細胞對致病菌的殺傷能力[4]。在細胞發生凋亡時，細胞膜上會出現一些異常的蛋白等標志物，鄰近的巨噬細胞更容易將其當成抗體，從而對其吞噬清除。機體清除結核分枝桿菌伴隨著細胞凋亡，細胞凋亡產生的異常蛋白又會對機體造成影響。因此，找到既可抑制細胞凋亡又可清除結核分枝桿菌的方法意義重大。研究發現，結核分枝桿菌感染人肺部巨噬細胞達到一定程度以后，TNF-α可介導巨噬細胞的外源性凋亡；巨噬細胞移動抑制因子（MIF）作為一種促炎癥細胞因子，可抑制結核分枝桿菌的生長繁殖；叉頭框轉錄因子3（FoxO3）是細胞的轉錄因子，可阻遏細胞周期。miRNA與肺結核的關系研究已有報道，但控制細胞凋亡的miRNA-223與肺結核的關系研究卻不多見。本研究通過建立肺結核大鼠模型，采用治療肺結核的藥物異煙肼喂養，以上述因子為基礎，探討影響巨噬細胞凋亡的關鍵基因及相應通路蛋白，以期為研究抑制細胞凋亡的同時殺死結核分枝桿菌提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料 成熟雌性SD大鼠60只，體重184～273（221.5±1.4）g，購自中國科學院上海實驗動物中心。異煙肼（北京雙鶴藥業股份有限公司，片劑，規格2ml∶0.1g）；TAE溶液（上海西唐生物科技有限公司）；瓊脂糖、TBST溶液（上海徠創生物科技有限公司）；TNF-α抗體、MIF抗體、β-actin（美國 Sigma公司）；PBS、細胞裂解液（武漢博士德生物科技有限公司）；RT-PCR引物由北京奧科生物公司合成。電泳儀（美國Bio-Rad公司）；離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型構建 將60只大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、給藥組，每組20只。正常組大鼠尾靜脈注射0.2ml 0.9%氯化鈉注射液。模型組和給藥組大鼠尾靜脈注射由結核患者痰液中分離的結核分枝桿菌（該桿菌已按結核病診斷細菌學檢驗規程驗證為結核分枝桿菌，取分裂旺盛的模型菌，用0.9%氯化鈉溶液溶解，每只大鼠注射0.2ml細菌懸液）。造模成功后，給藥組大鼠隔日一次性灌胃12 mg/ml異煙肼藥液1ml至造模第30天。監測各組大鼠造模第1、15、30天的體重變化。造模第30天時，以頸椎脫臼法處死各組大鼠，留取肺組織，委托上海捷瑞生物工程有限公司進行后續實驗。

1.2.2 大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落計數 取每只大鼠全部左肺組織，加入2ml 0.9%氯化鈉注射液后研磨成勻漿，再取組織液加等體積4%硫酸消化15min后，加入2.5mol NaOH調整至pH 7.0左右，接種于斜面培養基，置于37℃下培養5周，計數培養基上結核分枝桿菌菌落數。

1.2.3 大鼠肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。將×50的TAE溶液稀釋為×1的TAE溶液作為溶劑，稱取0.5g瓊脂糖，加入到TAE溶液中；于微波爐中加熱煮沸，后加入4μl核酸染料，搖晃混勻。將瓊脂糖凝膠水平放入電泳槽，依次加入5μl的 DNA Maker（β-actin）及 miRNA-223、FoxO3 PCR 引物（表1），拍照留存。以β-actin為內參，分析目的基因條帶灰度值。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取每只大鼠全部右肺組織，用PBS沖洗3次，加入細胞裂解液在混勻機下冰浴破碎，于12 000r/min離心機中4℃離心15min，收集上清液于-80℃下凍存，使用時沸水浴煮沸5min，4℃保存。把NC膜放入平皿，后在容器中添加脫脂奶粉并在搖床上暗處封閉0.5～1.5 h。棄去奶粉，取出硝酸纖維素（NC）膜置于TBST溶液中洗滌3次。洗滌以后加入TNF-α、MIF一抗，在4℃下孵育過夜。NC膜于第2天取出，將膜放于TBST溶液中洗滌4次后加入二抗孵育，將配置好的顯色液（a液和b液按1∶1的比例現用現配）滴加覆蓋于NC膜上，約1ml從右至左緩慢滴加，后于暗室中膠片沖洗，掃描留存。以β-actin為內參，分析目的蛋白條帶灰度值。

1.3 觀察指標 觀察并比較3組大鼠（1）造模第1、15、30天體重；（2）肺組織結核分枝桿菌菌落數；（3）肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA 表達水平；（4）肺組織 TNF-α、MIF蛋白表達水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS 20.1統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠造模第1、15、30天體重比較 見表2。

表2 3組大鼠造模第1、15、30天體重比較（g）

由表2可見，造模第1天，3組大鼠體重比較差異無統計學意義（P＞0.05）。造模第15、30天，3組大鼠體重比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），且正常組＞給藥組＞模型組（均P＜0.05）。

2.2 3組大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落數比較 見表3。

表3 3組大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落數比較

由表3可見，3組大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落數比較差異有統計學意義（P＜0.05），且正常組＜給藥組＜模型組（均P＜0.05）。

2.3 3組大鼠肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA表達水平比較 見表4。

表4 3組大鼠肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA表達水平比較

由表4可見，3組大鼠肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與正常組和給藥組比較，模型組大鼠肺組織miRNA-223表達水平降低，FoxO3 mRNA表達水平升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而給藥組與正常組大鼠肺組織miRNA-223、FoxO3 mRNA表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.4 3組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達水平比較見圖 1、表 5。

圖1 3組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達電泳圖

表5 3組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達水平比較

由圖1、表5可見，3組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與正常組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達水平均升高（均P＜0.05），給藥組大鼠肺組織MIF蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達水平均明顯降低（均P＜0.05）。

3 討論

結核病是一種由結核分枝桿菌引起的傳染性極強的疾病，且致死率較高。結核分枝桿菌是一類寄居于巨噬細胞中的寄生菌，不能獨自存活于人體內，當巨噬細胞被寄生以后發生凋亡，而后激活周圍的未被感染的巨噬細胞。本研究結果顯示，造模第1天，3組大鼠體重比較差異無統計學意義。而造模第15、30天，正常組大鼠體重＞給藥組大鼠體重＞模型組大鼠體重。且喂養中觀察到給藥組大鼠結核病整體癥狀較模型組輕很多，接近正常組，行動略緩慢，毛發略顯粗糙，有一定光澤，反應也與正常鼠很接近，說明經過異煙肼治療，可以使患病大鼠的癥狀減輕。

結核分枝桿菌菌落計數可直接反映結核病的嚴重程度。本研究結果表明，模型組大鼠肺組織體外培養結核分枝桿菌菌落數明顯高于正常組，正常組無結核分枝桿菌生長。給藥組與模型組相比，未見或少見結核分枝桿菌生長。這說明經過異煙肼治療以后患病大鼠的病癥明顯減輕，結核治療效果明顯。

TNF-α是由巨噬細胞產生的急性炎癥細胞因子。研究發現，在結核分枝桿菌感染人肺部巨噬細胞達到一定程度以后，會引起巨噬細胞的外源性凋亡，這一凋亡已被證實是由TNF-α介導的，沒有被感染的巨噬細胞無論在分泌TNF-α的水平上還是對TNF-α的敏感度上都低于被結核分枝桿菌感染的巨噬細胞，過量的TNF-α可以激活TNF受體，從而介導細胞凋亡[5-6]。本研究結果表明，模型組大鼠肺組織TNF-α、MIF蛋白表達水平均明顯高于給藥組、正常組，這說明大鼠患病程度和TNF-α表達水平有關，而異煙肼治療可以降低TNF-α表達水平，此結果也為監測結核病的嚴重程度提供可能的生物標志物。

miRNA與肺結核的關系研究已有報道[7-8]，miRNA可作為促進或抑制癌癥的因子，調控細胞凋亡[9-10]。本研究結果顯示，結核病的發生會影響miRNA-223的表達水平。模型組大鼠肺組織miRNA-223表達水平明顯低于正常組，而給藥組大鼠肺組織miRNA-223表達水平高于模型組。

Fox是細胞的轉錄因子，激活的FoxO3可以調控相關基因的轉錄，從而阻遏細胞周期[11-12]。本研究結果表明，模型組大鼠肺組織FoxO3表達水平明顯高于正常組，說明結核分枝桿菌導致的巨噬細胞的凋亡是通過FoxO3途徑；在給予異煙肼治療后，FoxO3表達水平明顯降低，基本接近正常水平。

綜上所述，本研究通過構建大鼠肺結核模型，分析大鼠患病期間各指標變化，結果顯示，模型組大鼠體重減輕，而給藥組大鼠癥狀相對不明顯。且本研究結果提示，異煙肼治療可上調肺結核大鼠肺組織miRNA-223的表達，下調FoxO3的表達。由此推測miRNA-223或通過靶向作用于FoxO3抑制相關凋亡基因及蛋白的表達，從而抑制肺結核大鼠巨噬細胞凋亡。