中期因子在絨毛膜癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系研究

姚紅麗 姚英武 崔開宇 李娟 仝進(jìn)毅 孫麗萍

中期因子（midkine，MK）屬于肝素結(jié)合因子的一種多肽，在人體胚胎發(fā)育期與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化有關(guān)。MK在胚胎時(shí)期高表達(dá)，出生后逐漸降低，在成年組織中，除腎臟和小腸上皮外，其他部位幾乎不表達(dá)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，MK在多種人類腫瘤中過(guò)度表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、浸潤(rùn)、分化及抗細(xì)胞凋亡等作用[1-3]，并且與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[4-5]。MK在絨毛膜癌（以下簡(jiǎn)稱絨癌）中的表達(dá)情況及其與絨癌的轉(zhuǎn)移、侵襲、預(yù)后的關(guān)系研究報(bào)道不多。本研究旨在分析MK在絨癌中的表達(dá)情況，探討MK表達(dá)與絨癌病理特征的關(guān)系，以期為絨癌的診治及預(yù)后判斷提供理論參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人絨癌細(xì)胞株JEG-3由中國(guó)科學(xué)院北京細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)提供，人絨癌細(xì)胞株JAR由中國(guó)科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所提供。

1.1.2 組織標(biāo)本 選取2012年1月至2017年12月在本院行手術(shù)治療32例絨癌患者的絨癌組織標(biāo)本，患者年齡 27～55（39.6±7.2）歲；其中腫瘤臨床分期Ⅰ期 12例、Ⅱ期5例、Ⅲ期11例、Ⅳ期4例。絨癌組織標(biāo)本均為患者手術(shù)切除的子宮組織標(biāo)本。患者臨床資料完整，術(shù)前均未接受過(guò)化療。

1.1.3 主要試劑和儀器 Transwell侵襲小室購(gòu)自美國(guó)Corning Costar公司。Matrigel體外侵襲試驗(yàn)?zāi)z購(gòu)自北京大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GibcoBRL 公司，PBS緩沖液（pH 7.2～7.6）購(gòu)自美國(guó) Sigma公司。免疫組織化學(xué)S-P試劑盒、兔抗人MK多克隆抗體、Western blot、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。兔抗人β-actin抗體及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京嘉美生物科技有限公司。Forma 3111型水套式二氧化碳培養(yǎng)箱為美國(guó)Forma公司產(chǎn)品。常、低溫超速離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人絨癌細(xì)胞株JEG-3、JAR的培養(yǎng) 將JEG-3、JAR細(xì)胞株接種于RPMI 1640培養(yǎng)液中，EG-3、JAR細(xì)胞均呈貼壁生長(zhǎng)，JEG-3細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。JEG-3、JAR細(xì)胞株均生長(zhǎng)良好，3d傳代1次。接種后的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞呈圓球形，大約4h后細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底部附著，貼壁生長(zhǎng)，隨即細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，進(jìn)入平臺(tái)期，此時(shí)細(xì)胞雖然有活力但不再分裂。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的JEG-3、JAR細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞體外侵襲能力檢測(cè) 采用Matrigel法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的JEG-3、JAR細(xì)胞，采用Transwell侵襲小室檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)400倍光鏡下的穿膜細(xì)胞數(shù)，觀察四周和中間的5個(gè)不同視野，取其平均數(shù)值。JEG-3、JAR細(xì)胞在體外的侵襲能力以穿膜細(xì)胞數(shù)量來(lái)表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞MK mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法分別檢測(cè)JEG-3、JAR細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48h時(shí)MK mRNA表達(dá)水平。參照RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，分別提取JEG-3、JAR細(xì)胞的總RNA 2μl，多聚胸腺嘧啶T重復(fù)寡核苷酸 Oligo（dT）15μl和適量雙蒸水（ddH2O）水混勻至總體積 13μl，70℃變性 5min，冰上放置 5min，再加入5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 5μl、dNTP 混合物 1μl、RNA 酶抑制劑1μl，MMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μl，ddH2O 4μl，至總體積為 25μl，混勻，42℃孵育60min，85℃滅活5min，冰上驟冷。再取40個(gè) EP管，每管分別裝入 RT產(chǎn)物 1.5μl，Taqmix 12.5μl，ddH2O 9μl，SYBR Green 1μl，擴(kuò)增的目的基因引物各1μl，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法擴(kuò)增。MK上游引物：5′-AGCAAAGGCCAAAGCCAAGA-3′，下游引物：5′-ACAAGGCAGGGCATGATTGA-3′。GAPDH 上游引物：5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′，下游引物：5′-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3′。反應(yīng)條件設(shè)為95℃預(yù)變性 3min，95℃變性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 50s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.4 絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞MK蛋白表達(dá)水平檢測(cè)采用Western blot法。分別提取JEG-3、JAR細(xì)胞的總蛋白，蛋白含量采用Bradford法檢測(cè)。每條泳道置入50μg的總蛋白，經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)膜及封閉，然后加入兔抗人MK一抗或β-actin抗體，4℃孵育過(guò)夜，用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（TBS）洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（1∶2 000），室溫條件下孵育1h，TBS洗膜3次，按ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色、曝光、沖洗X線片。Western blot檢測(cè)結(jié)果掃描后應(yīng)用Gel-pro Analysis圖像分析處理軟件進(jìn)行圖像吸光度值分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.5 絨癌組織MK蛋白表達(dá)情況檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法。將用石蠟包埋的絨癌組織標(biāo)本均連續(xù)4μm厚切片，采用S-P法進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色反應(yīng)，MK抗體的工作濃度為1∶150。用已知的MK和Ki-67陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照；0.01%mol/L PBS代替一抗，其余操作同正常免疫組化染色步驟，作為陰性對(duì)照。MK蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜中出現(xiàn)黃色、棕褐色顆粒。每張切片觀測(cè)10個(gè)具有代表性的高倍視野，每個(gè)高倍視野記數(shù)50個(gè)細(xì)胞，依據(jù)鏡下陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率綜合判斷。MK蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-），10%～20%為弱陽(yáng)性（+），21%～50%為中等陽(yáng)性（++），＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞體外侵襲能力；（2）比較不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞MK mRNA表達(dá)水平；（3）比較絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞MK蛋白表達(dá)水平；（4）分析絨癌組織MK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與臨床病理特征的關(guān)系，包括患者年齡、腫瘤臨床分期、國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）預(yù)后評(píng)分等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞體外侵襲能力比較 JEG-3細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)為（204.5±12.5）個(gè)/視野，JAR 細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)為（136.4±17.6）個(gè)/視野，JEG-3細(xì)胞穿膜數(shù)明顯多于JAR細(xì)胞，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即JEG-3細(xì)胞體外侵襲能力強(qiáng)于JAR細(xì)胞，見圖1。

圖1 絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞穿膜情況比較（×400）

2.2 絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞MK mRNA表達(dá)水平比較培養(yǎng)12、24、48h時(shí)，高侵襲性JEG-3細(xì)胞MK mRNA表達(dá)水平均高于低侵襲性JAR細(xì)胞，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見圖2。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞MK mRNA表達(dá)水平比較

2.3 絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞MK蛋白表達(dá)水平比較MK蛋白在高侵襲性JEG-3細(xì)胞中的表達(dá)水平為（1.87±0.20），在低侵襲性JAR細(xì)胞中的表達(dá)水平為（0.70±0.19）。JEG-3細(xì)胞MK蛋白表達(dá)水平高于JAR細(xì)胞，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、4。

圖3 絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞MK蛋白表達(dá)電泳圖

圖4 絨癌JEG-3、JAR細(xì)胞MK蛋白表達(dá)水平比較

2.4 絨癌組織MK蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系分析 分析絨癌組織MK蛋白表達(dá)情況與患者年齡、臨床分期、FIGO預(yù)后評(píng)分的關(guān)系，結(jié)果顯示MK蛋白在絨癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率與患者年齡無(wú)明顯關(guān)系，在＜40歲與≥40歲患者間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MK蛋白在臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的絨癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率高于Ⅰ～Ⅱ期的絨癌組織（P＜0.05），在FIGO預(yù)后評(píng)分高危的絨癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率高于低危的絨癌組織（P＜0.05），見表 1。

3 討論

MK存在于細(xì)胞的表面和細(xì)胞外基質(zhì)中，它對(duì)葡氨聚糖肝素和硫酸肝素具有高度親和力。妊娠中期可見MK大量表達(dá)，表明MK蛋白在妊娠的過(guò)程中起重要作用[6]。在成人身上，MK被限制在一定的組織中表達(dá)。然而，在腫瘤發(fā)生、炎癥和組織細(xì)胞修復(fù)過(guò)程中，MK的表達(dá)明顯上調(diào)。MK在多種人類惡性腫瘤中均高度表達(dá)，如頭頸部腫瘤、消化道腫瘤、泌尿系統(tǒng)腫瘤等[7-9]，且MK可能參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過(guò)程，并與不良預(yù)后有關(guān)[10-11]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)MK在絨癌高侵襲性JEG-3細(xì)胞、低侵襲性JAR細(xì)胞及絨癌組織中均有不同程度表達(dá)，提示MK可能與絨癌的侵襲性改變有關(guān)。

表1 絨癌組織MK蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系分析

Huang等[12]采用免疫組織化學(xué)和RT-PCR技術(shù)對(duì)胃癌組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MK表達(dá)水平與腫瘤臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈有關(guān)，表明MK對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。Ma等[13]發(fā)現(xiàn)MK表達(dá)陽(yáng)性可獨(dú)立預(yù)測(cè)肝膽管細(xì)胞癌復(fù)發(fā)，發(fā)現(xiàn)MK表達(dá)陽(yáng)性預(yù)示可切除的肝膽管細(xì)胞癌患者預(yù)后不良。Xia等[14]表明MK在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平越高，癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，提示預(yù)后不良。Taku等[15]采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn)，血清MK水平為患者生存的獨(dú)立預(yù)后因子，過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致患者死亡的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)上升，且血清MK水平與化療敏感性有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示MK蛋白在絨癌組織中的表達(dá)與臨床分期及FIGO預(yù)后評(píng)分有關(guān)，臨床分期越晚、FIGO預(yù)后評(píng)分高危的絨癌組織MK蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示MK與絨癌侵襲及預(yù)后相關(guān)。

絨癌屬于妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的一種，是源于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的惡性疾病。因此，研究MK在絨癌中的表達(dá)情況意義重大，可能通過(guò)干預(yù)MK基因在絨癌中的表達(dá)，從而干預(yù)絨癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，達(dá)到改善患者預(yù)后的目的。為研究MK高度表達(dá)與絨癌侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，本研究小組前期研究發(fā)現(xiàn)絨癌組織中MK的表達(dá)明顯強(qiáng)于侵蝕性葡萄胎及葡萄胎組織，提示MK可能是促進(jìn)絨癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素，其表達(dá)水平升高可能增強(qiáng)絨癌細(xì)胞的侵襲能力[16]。為進(jìn)一步研究MK高度表達(dá)與絨癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，本研究采用Matrigel體外侵襲試驗(yàn)、Western blot法、RT-PCR從蛋白及mRNA水平對(duì)MK在絨癌組織及細(xì)胞株中進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)隨著絨癌臨床分期的升高M(jìn)K的表達(dá)明顯增強(qiáng)；而且高侵襲性JEG-3細(xì)胞中MK的表達(dá)水平明顯高于低侵襲性JAR細(xì)胞。這表明絨癌組織中MK的表達(dá)增強(qiáng)可能是促進(jìn)絨癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素，同時(shí)也影響了絨癌患者的預(yù)后。但其具體分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。Lu等[8]研究膽管癌細(xì)胞系對(duì)吉西他濱化療耐藥機(jī)制，發(fā)現(xiàn)MK促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），當(dāng)EMT被小干擾（si）RNA靶向Twist阻斷時(shí)，MK對(duì)吉西他濱耐藥的增強(qiáng)作用被消除。此外，MK促進(jìn)了Notch-1的表達(dá)，而siRNA敲低Notch-1則阻斷了膽管癌細(xì)胞系的EMT過(guò)程。這說(shuō)明MK通過(guò)上調(diào)Notch-1誘導(dǎo)EMT促進(jìn)膽管癌的吉西他濱耐藥，促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。此外，對(duì)皮膚黑色素瘤的研究表明，MK是決定患者預(yù)后的新淋巴管生成的系統(tǒng)誘導(dǎo)物，MK的這一作用與淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中mTOR通路的旁分泌激活有關(guān)[17]。

綜上所述，MK在絨癌組織中高表達(dá)，且與絨癌細(xì)胞侵襲能力有關(guān)，其表達(dá)陽(yáng)性率隨絨癌分期的升高而增高。MK在絨癌的侵襲、進(jìn)展中起至關(guān)重要的作用，可作為判斷絨癌惡性程度和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。