電針合谷對牙髓痛大鼠模型三叉神經節和牙髓中 P2X4受體的影響

張英,陳莉,劉宇煒,樂凱,嚴琴,李超英

(1.江漢大學,武漢 430056;2.湖北省中山醫院,武漢 430033)

牙髓痛為口腔疾患中常見的癥狀之一[1-2],可見于西醫學的齲齒、牙髓炎、根尖周圍炎和牙本質過敏等[3-5]。中醫學稱之為“骨槽風”“牙咬痛”“牙宣”[6-7]。針刺合谷對牙髓痛具有良好的鎮痛作用[8-10],但其作用機理尚不明確。P2X受體作為配體門控型離子通道,在體內組織、部位均有表達,當前已克隆出P2X1-77種亞型[11], P2X1-6亞型大多在初級感覺神經元表達,如結狀神經節、背根神經節及三叉神經節。近年來已有研究證實P2X受體中 P2X4受體與神經病理痛相關[12],在疼痛信息的傳遞過程中起重要作用[13-15]。電針合谷治療牙髓痛的作用與P2X4受體的關系還不明確。本實驗以大腸桿菌內毒素(LPS)誘導的牙髓痛大鼠為研究對象,利用RT-PCR檢測三叉神經節和牙髓中P2X4受體mRNA的表達量,以探索電針合谷治療牙髓痛的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

牙體、牙列完整,無齲壞、牙齒畸形及牙周病,咬合正常的健康成年雄性SD大鼠42只,由武漢大學動物實驗中心提供,許可證號為 SCXK(鄂)2008-0004,體質量180～250 g,隨機分為正常組(N組)、對照組(C組)、牙髓痛組(M組)、拮抗劑組(A組)、電針組(E組)、拮抗劑+電針組(AE組),每組7只。

1.2 主要藥品與儀器

微量移液器(德國Eppendorf公司),Realtime PCR儀(ABI公司),冷凍離心機(Sigma公司),大腸桿菌內毒素(上海禾豐制藥,生產批號 120801),A-317491(美國Sigma公司),Trizol(Invitrogen公司),氯仿、異丙醇、無水乙醇(滬試公司),PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ(TAKARA 公司),β-actin引物(上海生工公司),P2X4引物(上海生工公司)。

1.3 動物造模及治療方法

N組不做任何處理;C組在鉆好的牙髓腔內注入與M組等量的生理鹽水,浸潤5～6 min后用牙科填料將牙洞封閉;M組用小型電鉆或手鉆(鉆頭直徑約 1 mm)在上頜一側第一和第二磨牙上鉆孔,深入牙髓腔并暴露牙髓,用微量注射器注入濃度為 5 μg/μL的大腸桿菌內毒素(LPS)溶液(每孔注入約 1～3 μL),浸潤 5～6 min后用牙科填料將牙洞封閉[16];A組同M組造模后,在注射器注入LPS溶液時,將A-317491(0.5 mg/kg)同時注射進牙髓;E組針刺雙側合谷[17]穴,接電針治療儀,選連續波,頻率2 Hz,強度為1 mA,留針30 min,每日1次,共治療3次;AE組同M組造模后,在注射器注入LPS溶液時,將 A-317491(0.5 mg/kg)同時注射進牙髓,針刺雙側合谷穴,接電針治療儀,選連續波,頻率2 Hz,強度為1 mA,留針30 min,每日1次,共治療3次。

1.4 樣本采集

大鼠腹腔注射 10%水合氯醛麻醉后斷頸處死,立即取出三叉神經節、牙髓。

1.5 行為學分析

觀察每組大鼠開始治療第一天至最后一天的體質量變化及外觀變化,觀察每組大鼠造模后半小時行為學變化,包括大鼠甩頭、嘶叫和舔足動作[18-20]。具體行為學觀測方法：每天將各組大鼠經造模后,放入 Face Crooming觀測儀內,待其適應環境5 min后,通過儀器底部的攝像機進行實時拍攝,并分別記錄每只大鼠在30 min內甩頭、嘶叫和舔足動作次數。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應(ReaI-time poIymerase chain reaction, RT-PCR)檢測三叉神經節、牙髓中P2X4受體基因(messenger RibonucIeic Acid, mRNA)表達

1.6.1 逆轉錄反應

用 Trizol RNA提取試劑盒提取三叉神經節總RNA。將 4 μL 5×RT Buffer、2 μL dNTP、1 μL Oliga(dT)18、1 μL RNase Inhibitor、1 μL ReverTra Ace和1 μg RNA,加RNase free H2O調至20 μL。42℃ 20 min,將mRNA逆轉錄為cDNA,95℃ 5 min滅活逆轉錄酶后-20℃保存。

1.6.2 實時熒光定量檢測P2X4的mRNA

采用SYBR Green熒光染料法針對P2X4的mRNA進行實時RT-PCR檢測,吸取逆轉錄反應產物10 μL引物上下游各 2 μL,加緩沖液 10 μL、ddH2O 4 μL及 SYBR Green熒光染料1 μL,放入熒光定量PCR儀,50℃持續2 min,接著95℃持續10 min,然后95℃持續15 s,退火1 min后,95℃持續15 s,然后60℃持續15 s,最后95℃持續 15 s,如上進行 45個循環,經 4℃延伸10 min。設置陰性對照和β-actin內參照。對P2X4受體CT值進行標準化,得到各組P2X4受體mRNA相對表達量。

1.7 統計學方法

所有數據采用 SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way-ANOVA),繼以 LSD檢驗,實驗結果以均數±標準差表示。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學及體質量變化情況

正常大鼠皮毛光潤,行動自如,體質量穩定增長。LPS造模后大鼠皮毛萎縮無光澤,行動遲緩,并有體質量增加不明顯等現象。觀察造模后30 min大鼠的行為變化可以發現,造模大鼠甩頭、嘶叫和舔足次數明顯增多,各組大鼠行為學及體質量變化情況見表1和表2。

由表1可以看出,M組、A組、E組、AE組行為學變化均顯著高于C組和N組(P＜0.01);A組、E組、AE組行為學變化均顯著低于M組(P＜0.01)。

由表 2可以看出,C組體質量顯著低于 N組(P＜0.01);M組、A組、E組、AE組體質量均顯著低于 C組和N組(P＜0.01);E組、AE組體質量均顯著高于M組(P＜0.01);A組體質量稍高于M組(P＜0.05);AE組體質量顯著高于A組和E組(P＜0.01);E組體質量稍高于A組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠行為學變化 (±s,次)

表1 各組大鼠行為學變化 (±s,次)

注：與 N組比較1)P＜0.01;與 C組比較2)P＜0.01;與 M組比較3)P＜0.01

組別 n 甩頭次數和 嘶叫次數和 舔足次數和N 組 7 5.6±1.15 1.8±1.30 7.0±1.58 C 組 7 5.8±1.30 2.2±0.45 7.2±1.10 M 組 7 14.0±1.581)2) 7.4±1.141)2) 17.4±1.521)2)A 組 7 12.0±1.481)2)3) 5.2±0.841)2)3) 13.0±1.581)2)3)E 組 7 11.2±1.301)2)3) 5.6±0.891)2)3) 13.4±1.141)2)3)AE 組 7 10.4±1.141)2)3) 5.0±1.001)2)3) 12.0±1.581)2)3)

表2 各組大鼠體質量變化 (±s,g)

表2 各組大鼠體質量變化 (±s,g)

注：與 N組比較1)P＜0.01;與 C組比較2)P＜0.01;與 M組比較3)P＜0.01,4)P＜0.05;與A組比較5)P＜0.01,6)P＜0.05;與E組比較7)P＜0.01

組別 n 體質量差值N組 7 15.43±2.55 C組 7 13.45±2.691)M組 7 4.61±3.701)2)A組 7 6.50±2.321)2)4)E組 7 7.39±2.751)2)3)6)AE組 7 8.81±3.741)2)3)5)7)

2.2 電針合谷對大鼠三叉神經節和牙髓中 P2X4受體mRNA表達量的影響

由表3可以看出,C組三叉神經節P2X4受體mRNA表達量稍高于 N組(P＞0.05);M組、A組、E組、AE組 P2X4受體 mRNA表達量明顯高于 N組(P＜0.01);M組、E組、AE組P2X4受體mRNA表達量高于C組(P＜0.05);A組 P2X4受體 mRNA表達量高于 C組(P＜0.01);E組、AE組大鼠P2X4受體mRNA表達量低于M組(P＜0.01)。

由表4可以看出,C組牙髓P2X4受體mRNA表達量稍低于N組(P＞0.05);M組、A組、E組、AE組P2X4受體mRNA表達量明顯高于N組(P＜0.01);M組、A組、E組、AE組P2X4受體mRNA表達量高于C組(P＜0.01);E組、AE組大鼠 P2X4受體 mRNA表達量低于 M組(P＜0.01)。

表3 各組大鼠三叉神經節P2X4受體mRNA相對表達量比較(±s)

表3 各組大鼠三叉神經節P2X4受體mRNA相對表達量比較(±s)

注：與N組比較1)P＜0.01;與C組比較2)P＜0.01,3)P＜0.05;與M組比較4)P＜0.01

組別 n P2X4受體mRNA相對表達量N組 7 0.269±0.036 C組 7 0.308±0.046 M組 7 0.353±0.0271)3)A組 7 0.387±0.0291)2)E組 7 0.347±0.0311)3)4)AE組 7 0.332±0.0311)3)4)

表4 各組大鼠牙髓P2X4受體mRNA相對表達量比較(±s)

表4 各組大鼠牙髓P2X4受體mRNA相對表達量比較(±s)

注：與N組比較1)P＜0.01;與C組比較2)P＜0.01;與M組比較3)P＜0.01

組別 n P2X4受體mRNA相對表達量N組 7 1.065±0.043 C組 7 1.023±0.079 M組 7 1.768±0.0471)2)A組 7 1.888±0.1311)2)E組 7 1.693±0.0811)2)3)AE組 7 1.728±0.3201)2)3)

3 討論

牙髓痛由牙髓的神經末梢傳導至外周感受器三叉神經節的感受神經元,經收集后傳入下一級神經元,最后到中樞相應部位,由大腦皮層作出痛反應[21-23]。牙髓內僅存在傷害感受器/疼痛感受器,當牙髓受到刺激時,唯一的感覺就是痛[18]。動物不能用言語表達其疼痛狀態,創建病理性疼痛模型還需利用行為學觀察進行分析,目前運用較多是采用不同的行為學方法評價牙髓痛模型[18-20],如甩頭、嘶叫和舔足等。LPS誘導的炎性牙髓痛大鼠痛反應明顯增強,牙髓痛組與正常大鼠相比,牙髓痛組大鼠食量減少、體質量增長緩慢、皮毛光澤度降低,且出現甩頭、嘶叫和舔足等疼痛表現增多,提示LPS誘導大鼠牙髓痛模型的可行。

P2X受體作為非選擇性配體門控型離子通道可與細胞外ATP結合,允許Na+、K+、Ca2+離子通過[24],誘發動作電位沿神經軸突向中樞神經系統傳導,從而產生痛覺[25],在機體痛覺的構成、傳導和調節中起重要作用[26-27]。P2X4受體在小膠質細胞及外周巨噬細胞均有表達,參與感覺神經元興奮及痛覺產生[28-29]。實驗顯示髓痛組大鼠三叉神經節、牙髓中 P2X4受體 mRNA表達量均顯著高于對照組、正常組。由此可推斷P2X4受體參與牙髓痛的信號傳導。

P2X受體亞型P2X3受體在神經病理性疼痛中發揮重要作用[30-32],A-317491是P2X3受體特異性拮抗劑,可有效抑制P2X3受體的表達[33]。而前期的研究發現P2X3受體高表達于牙髓痛模型,A-317491作為拮抗劑可有效抑制 P2X3受體高表達,從而產生鎮痛效應[34]。本次實驗顯示拮抗劑組大鼠三叉神經節和牙髓中 P2X4受體 mRNA表達量與牙髓痛組無明顯統計學差異,說明A-317491作為P2X3受體的特異性拮抗劑,對P2X4受體并無明顯抑制作用。

合谷是手陽明大腸經的原穴,出自《靈樞·本輸》,善治頭面、五官疾患,是針灸臨床治療牙痛的效穴。實驗顯示,電針組、拮抗劑+電針組兩組大鼠三叉神經節、牙髓中P2X4受體mRNA表達量明顯低于牙髓痛組,提示電針合谷可抑制 P2X4受體的表達,從而抑制牙髓痛傷害信息的傳導。于此同時,電針組、拮抗劑+電針組大鼠三叉神經節、牙髓中 P2X4受體 mRNA表達量無統計學差異,說明在電針合谷有效抑制P2X4受體,與拮抗劑的參與與否并無明顯影響,由此推斷電針合谷不但能協同拮抗劑 A-317491抑制 P2X3受體表達產生鎮痛效應,而且某種程度上更優于拮抗劑A-317491能進一步抑制P2X4受體表達,從而達到鎮痛作用。

本研究結果提示P2X4受體參與了實驗性牙髓痛的產生與傳導,電針對牙髓痛的鎮痛作用與 P2X4受體參與密切相關,這可能是電針合谷鎮痛的機制之一,電針合谷如何調節 P2X4受體的信號轉導還有待進一步研究。