薰衣草提取物的體外抗氧化活性及酶抑制活性研究

王苗苗,嚴 歡,田 合,毛瓊玲,張 倩,李慕春

(新疆維吾爾自治區分析測試研究院,新疆天然產物綠色加工工程技術研究中心,新疆烏魯木齊 830011)

薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)又名靈香草,唇形科薰衣草屬,原產于法國和意大利南部地中海沿海及非洲、西班牙等地,是一種珍貴的天然香料植物,其香氣清香肅爽、濃郁宜人[1-2]。經過多年培植,薰衣草在天山腳下伊犁河畔形成規模。新疆伊犁哈薩克自治州,是中國薰衣草種植加工的主要產地,同時也是亞洲地區最大的香料生產基地。薰衣草作為維藥入藥已有多年的歷史,維吾爾醫用其治療腹脹胸悶、感冒咳喘、頭暈頭痛、心悸氣短,關節骨痛等[3-6]。薰衣草富含揮發油、黃酮、香豆素、單寧等,部分次生代謝物由植物防御機制產生,與其治療特性有關[7-8]。事實上,目前許多植物衍生的藥物正處于臨床試驗階段,或者用于治療各種疾病。

研究表明薰衣草等藥用植物作為生物活性物質的來源,比如天然抗氧化劑、抗老化劑等,越來越受到人們的重視。許多研究證明,天然抗氧化劑可以降低各種慢性疾病的風險,如阿爾茨海默氏癥(AD)等[9-10]。雖然阿爾茨海默氏癥的發病機制尚不清楚,但目前可能的假設之一是由于海馬體和大腦皮質缺乏乙酰膽堿所致[11-12]。在水解神經遞質乙酰膽堿的過程中,乙酰膽堿酯酶(ACHE)和丁酰膽堿酯酶(BCHE)扮演著重要的角色,因此,使用這些酶的抑制劑被認為是一種有效的治療方法。黑色素可以防止紫外線對皮膚、頭發和眼睛造成傷害,但過量則與神經退行性疾病如帕金森病有關[13-15]。酪氨酸酶是一種催化生成黑色素的酶,它的抑制劑可能對治療皮膚癌或其他與黑色素過度相關的皮膚病有益。然而,薰衣草對于乙/丁酰膽堿酯酶、酪氨酸酶抑制活性的研究鮮有報道。

基于此,本文研究薰衣草組分抗氧化活性及其對乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶、酪氨酸酶的抑制活性,為生物活性化合物的發現提供理論基礎,為疾病的治療提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水乙醇、乙腈、甲醇 天津富宇精細化工有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀 天津市致遠化學試劑有限公司;乙酸鈉 天津市福晨化學試劑廠;三氯化鐵、氫氧化鈉 天津盛奧化學試劑有限公司;硫酸亞鐵 西安化學試劑廠;三氯乙酸 天津市大茂化學試劑廠;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridyl-s-triazine,TPTZ)、碘化硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine iodide,ATCI)、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid),DTNB)、石杉堿甲 阿拉丁試劑(上海)有限公司;抗壞血酸(Ascorbic Acid,VC) 鄭州市化學試劑三廠;乙酰膽堿酯酶(Acetyl cholinesterase,ACHE)、氯化丁酰巰基膽堿(Butyl mercaptocholine chloride,BUSCH)、左旋多巴(L-多巴) 西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;丁酰膽堿酯酶(Butyrylcholinesterase,BUCHE) 上海源葉生物科技有限公司;L-酪氨酸 天津市精細化工研究所;酪氨酸酶、曲酸 上海麥克林生化科技有限公司;總抗氧化能力檢測試劑盒A015 南京建成生物工程研究所;薰衣草干花 伊犁紫蘇麗人生物科技有限公司。

RT-02A碎樣機 北京開創同和科技發展有限公司;TE612-L電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;XS-204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;LC-20AP島津制備液相、UV-2700紫外分光光度計 日本島津公司;數顯恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;Synergy H1伯騰酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;Milli Q超純水系統 美國密理特公司;石英比色皿 大連市日普利科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 薰衣草組分庫的制備 稱取500.00 g薰衣草干花顆粒,不經粉碎,加入8 L石油醚,浸泡1 h,80 ℃,冷凝回流提取1.5 h,多層紗布過濾,留濾渣;濾渣風干后,加入8 L 70%乙醇溶液,80 ℃冷凝回流提取1.5 h,多層紗布過濾,重復提取一次,濾液合并。濾液于旋轉蒸發儀中濃縮,真空冷凍干燥后,得到薰衣草提取物。

稱5.00 g提取物用50 mL DMSO溶解后,得100 mg/mL溶液,通過島津制備液相制備不同的組分。

制備液相分析條件如下:YMC Triart Prep C18柱(50 mm×250 mm×10 μm);流動相:以0.1%甲酸-水溶液為流動相A相,以乙腈為流動相B相;洗脫程序為:0～60 min,B由15%→25%;60～90 min,B由25%→30%;90～120 min,B由30%→60%;120～125 min,B由60%→15%;125～150 min,B由15%→15%;檢測波長為280、254 nm;柱溫:40 ℃;手動進樣,進樣量:2 mL;流速:40 mL/min;時間:150 min。采用餾分收集器收集洗脫液,每隔3 min收集一份,運行一次得50個組分。重復進樣20針,濃縮,凍干,得薰衣草組分庫(50個組分)。

分別稱2.0 mg組分庫各樣品,用乙腈-水溶液溶解,定容至50 mL,配制成0.040 mg/mL的樣品液,用于試驗分析。

1.2.2 DPPH自由基清除實驗 參照文獻[16-17]方法。準確稱量1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)粉末14.2 mg,乙醇充分溶解配制成0.72 mmol/L儲備液,低溫避光保存;臨用前用乙醇稀釋為0.072 mmol/L使用。實驗時,樣品組(A1):于10 mL比色管中加入1.0 mL樣品液,再加入3.0 mL 72 μmol/L的DPPH溶液,充分混勻后,37 ℃避光反應1 h,測定516 nm處吸光度值;樣品對照組(A2)使用異常替代DPPH,空白組(A0)使用乙醇替代樣品液。抗壞血酸作為陽性對照。樣品DPPH清除率的計算公式為:

DPPH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.3 鐵離子還原力測定(FRAP)實驗 FRAP工作液的配制:由300 mmol/L乙酸鈉溶液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液(由40 mmol/L配制)及20 mmol/L三氯化鐵溶液按體積比10∶1∶1配制而成,現用現配。配制好后置于37 ℃水浴中溫育備用。

標準曲線制作:準確稱取硫酸亞鐵粉末55.6 mg,超純水充分溶解后配制成4 mmol/L標準儲備液。使用前稀釋成0.001、0.005、0.010、0.025、0.100、0.200、0.400、0.500、0.750、1.000 mmol/L等不同濃度。分別取不同濃度硫酸亞鐵標液200 μL于10 mL比色管中,加入配制好的FRAP工作液3.0 mL,加入超純水1.9 mL,充分混勻,室溫避光反應50 min,測定596 nm處吸光度值,制作標準曲線。超純水做空白對照[18-19]。

樣品測定:分別取各薰衣草樣品200 μL于10 mL比色管中,加入配制好的FRAP工作液3.0 mL,加入超純水1.9 mL,充分混勻,室溫避光反應50 min,測定596 nm處吸光度值,由標準曲線查出相同吸光度值對應的硫酸亞鐵濃度值,樣品還原力用硫酸亞鐵濃度(mmol/L)表示。抗壞血酸作為陽性對照。

1.2.4 總抗氧化能力(T-AOC)測定 配制T-AOC工作液:按總抗試劑盒說明書要求分別準備好試劑1、2、3溶液,按體積比2∶4∶1充分混合,置于37 ℃水浴中溫育備用。

樣品測定:樣品組(A1):取0.1 mL樣品加入3.5 mL工作液,充分混勻后,37 ℃水浴避光反應30 min,加入試劑4溶液0.1 mL,充分混勻后靜置10 min,測定520 nm處吸光度值,超純水做空白;對照組(A2)中樣品在加入試劑4溶液后再加入,其余操作同樣品組[20]。抗壞血酸作為陽性對照。

總抗氧化能力單位:在37 ℃時,每分鐘每毫升樣品液使反應體系的吸光度(OD)值每增加0.01時,為一個總抗氧化能力單位。總抗氧化能力計算公式如下:

總抗氧化能力(U/mL溶液)=(A1-A2)×3.7×1/0.01/30/0.1

式中:A1:樣品測定組吸光度;A2:樣品對照組吸光度;3.7:反應液總體積,mL;1:樣品測試前稀釋倍數;0.01:總抗氧化能力單位定義相關系數;30:反應時間,min;0.1:取樣量,mL。

1.2.5 總還原力測定 在10 mL比色管中加入0.5 mL樣品,加入2.5 mL PBS緩沖液(0.2 mol/L,pH=6.6),再加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴20 min后,加入2.5 mL 10%三氯乙酸;3000 r/min離心10 min;取2.5 mL上清液于另一比色管中,加入2.5 mL超純水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,充分混合,靜置10 min后,于700 nm處測定吸光度值[21]。

1.2.6 乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選試驗 參照Ellman法進行稍許修改,于96孔酶標板上進行樣品乙酰膽堿酯酶抑制活性實驗[22-23]。具體操作如下:樣品組(A1):在96孔板中加入134 μL PB buffer(0.1 mol/L,pH=7.5)、4 μL 乙酰膽堿酯酶(ACHE,1 U/mL)和4 μL樣品液,4 ℃孵育20 min后,加入DTNB(10 mmol/L)和ATCI(10 mmol/L)各4 μL,37 ℃孵育20 min,在405 nm處測定吸光度值;樣品對照組(A2)使用4 μL PB buffer 替代4 μL ACHE,空白組(A3)使用4 μL PB buffer替代4 μL樣品液,完全抑制組(A4)使用4 μL 10 μg/mL石杉堿甲替代4 μL樣品液。樣品乙酰膽堿酯酶活性抑制率計算公式如下:

抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100

1.2.7 丁酰膽堿酯酶抑制劑篩選試驗 參照Ellman法進行稍許修改,于96孔酶標板上進行樣品丁酰膽堿酯酶抑制活性實驗[23-24]。具體操作如下:樣品組(A1):在96孔板中加入160 μL PB buffer(0.1 mol/L,pH=7.5)、10 μL 丁酰膽堿酯酶(BUCHE,1 U/mL)和10 μL樣品液,4 ℃孵育20 min后,加入DTNB(5 mmol/L)和BUSCH(5 mmol/L)各10 μL,37 ℃孵育20 min,在412 nm處測定吸光度值;樣品對照組(A2)使用4 μL PB buffer替代4 μL BUCHE,空白組(A3)使用4 μL PB buffer替代4 μL樣品液,完全抑制組(A4)使用4 μL 10 μg/mL石杉堿甲 替代4 μL樣品液。樣品丁酰膽堿酯酶活性抑制率計算公式如下:

抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100

1.2.8 酪氨酸抑制活性研究

1.2.8.1 單酚酶抑制活性的測定 樣品組(A1):在96孔酶標板上加入L-酪氨酸(0.5 mmol/L)50 μL,樣品液25 μL,混勻后37 ℃孵育5 min,加入酪氨酸酶50 μL(250 U/mL),混勻后37 ℃孵育25 min,于490 nm處測定吸光度值;樣品對照組(A2)使用50 μL PBS替代50 μL酪氨酸酶;空白組(A3)使用25 μL PBS替代25 μL樣品液;空白對照組(A4)使用25 μL PBS替代25 μL樣品液,并使用50 μL PBS(0.2 mmol/L,pH=6.8)替代50 μL酪氨酸酶[25-27]。使用10 μg/mL曲酸作為陽性對照。抑制率計算公式如下:

抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100

1.2.8.2 二酚酶抑制活性的測定 樣品組(A1):在96孔酶標板上加入L-多巴(0.5 mmol/L)50 μL,樣品液30 μL,混勻后37 ℃孵育5 min,加入酪氨酸酶25 μL(100 U/mL),混勻后37 ℃孵育25 min,于475 nm處測定吸光度值;樣品對照組(A2)使用25 μL PBS(0.2 mmol/L,pH=6.8)替代25 μL酪氨酸酶;空白組(A3)使用30 μL PBS替代30 μL樣品液;空白對照組(A4)使用30 μL PBS替代30 μL樣品液,并使用25 μL PBS替代25 μL酪氨酸酶。使用10 μg/mL曲酸作為陽性對照。抑制率計算公式如下:

抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100

1.3 數據處理

所有試驗均做3組平行,采用SPSS 17.0和Origin 8進行數據分析處理,結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 薰衣草組分庫制備

對薰衣草組分庫進行制備液相分析,結果如圖1,運行時間150 min,每3 min收集一個餾分,獲得0～49號管,共50個組分。

圖1 薰衣草提取物的制備液相色譜圖

2.2 DPPH自由基清除率測定結果

DPPH是一種比較穩定的自由基,其乙醇水溶液呈較深的紫色,在波長516 nm處有強吸收,如果樣品中的抗氧化物質可將其清除,則吸光將會減弱,可以根據吸光度值減少的程度來判斷樣品抗氧化能力的強弱。

對薰衣草組分庫的50個樣品進行了DPPH自由基清除率測定,由表1可知,50個樣品對DPPH表現出了不同程度的清除作用。其中25#(90.29%±4.51%)、26#(93.95%±4.70%)、27#(92.42%±4.62%)、35#(93.39%±4.67%)、36#(92.96%±4.65%)組分對DPPH自由基的清除率達到90%以上,具有較高的清除DPPH自由基活性,與50 μg/mL陽性化合物抗壞血酸(93.47%±4.67%)的清除率差異顯著(p<0.05)。其余組分的DPPH自由基清除率在15%～25%和55%～75%之間,由此可知,薰衣草組分庫的50個樣品對DPPH的清除作用明顯,抗氧化活性高。

2.3 FRAP測定結果

以FeSO4為標準物質繪制標準曲線(見圖2),得標準曲線方程為A=0.9589C+0.0406,決定系數R2=0.999,由標準曲線查出樣品吸光度值對應的硫酸亞鐵濃度值(mmol/L),以此表示樣品的抗氧化能力。

圖2 FeSO4標準曲線

抗氧化物質在酸性條件下可以將Fe3+-TPTZ還原成為藍色的Fe2+-TPTZ,之后在593 nm處測定吸光度,即可根據吸光度值大小判斷樣品抗氧化能力的大小。由表1可知26#(0.647±0.039 mmol/L FeSO4)、27#(0.499±0.030 mmol/L FeSO4)、36#(0.400±0.024 mmol/L FeSO4)組分的FRAP值均顯著高于陽性對照10 μg/mL 抗壞血酸(0.387±0.023 mmol/L FeSO4)的FRAP值,具有較強的抗氧化活性,這與DPPH自由基清除率實驗結果也具有一致性;但1#～8#、40#～50#組分的FRAP值小于0.1 mmol/L FeSO4,抗氧化活性弱;其余組分的FRAP值均在0.1～0.3 mmol/L FeSO4,抗氧化活性各不相同,但差異不顯著。

2.4 總抗氧化能力測定結果

對薰衣草組分庫中的50個樣品進行總抗氧化能力的測定結果見表1,26#(6.210±0.373 U/mL)、27#(3.575±0.214 U/mL)組分具有較高的總抗氧化能力值,均顯著(p<0.05)高于陽性對照10 μg/mL抗壞血酸(2.602±0.156 U/mL);31#(2.427±0.146 U/mL)、35#(2.427±0.146 U/mL)組分總抗氧化能力值小于陽性對照,具有較好的總抗氧化能力;10#～40#組分的總抗氧化能力雖各不相同,但都≥1 U/mL;其余個組分總抗氧化能力較弱。

2.5 還原力測定結果

還原力是抗氧化活性高低的一個重要指標。樣品中的抗氧化物質將反應體系中的三價鐵離子還原成二價鐵離子,在波長700 nm處具有強吸收,吸光度越高表明還原能力越強。由表1可知,26#(0.234±0.026)、27#(0.179±0.020)、35#(0.122±0.013)、36#(0.137±0.015)組分具有高的吸光度值,具有強的還原能力;陽性對照100 μg/mL 抗壞血酸的吸光度(0.412±0.045),為這些組分的2～3倍;20#～25#吸光度在0.1000附近,還原能力次之;其余組分吸光度低,還原能力弱。通過DPPH、FRAP、T-AOC及還原力測定,可知組分庫中26#、27#、35#、36#組分具有高的抗氧化活性,具有成為天然抗氧化劑的潛能,可進一步研究探索。

表1 抗氧化活性測定結果

2.6 膽堿酯酶抑制活性研究

對薰衣草組分庫中的50個樣品進行了乙/丁酰膽堿酯酶抑制劑篩選試驗,結果見表2。由表2可知16#(66.37%±5.82%)、18#(69.73%±1.91%)、19#(68.20%±1.03%)、20#(74.98%±2.28%)、24#(60.83%±2.23%)、37#(76.37%±1.97%)組分乙酰膽堿酯酶抑制率均大于60%,抑制活性高。20#～40#組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性顯著高于其它組分,抑制率在40%～60%之間。其余組分抑制活性低。薰衣草組分庫50個組分的丁酰膽堿酯酶抑制活性與乙酰膽堿酯酶抑制活性相比較低。其中24#(20.58%±3.71%)、25#(20.53%±2.97%)、39#(20.31%±3.48%)、43#(21.44%±2.16%)、46#(23.37%±3.69%)丁酰膽堿酯酶抑制率大于20%,其余各組分抑制率均小于20%,丁酰膽堿酯酶抑制活性普遍較低。其中24#對于乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的綜合抑制活性顯著高于其他組分。

表2 乙酰膽堿酯酶抑制活性和丁酰膽堿酯酶抑制活性測定結果

2.7 酪氨酸抑制劑篩選

以L-酪氨酸為底物,對薰衣草組分庫中的50個組分進行了酪氨酸酶單酚酶抑制活性研究,結果見表3。酪氨酸酶單酚酶抑制活性研究時需要較高活性的酪氨酸酶,薰衣草組分庫的各組分對單酚酶的抑制率普遍低于70%。其中16#(58.73%±4.18%)、17#(59.92%±0.69%)、18#(59.92%±0.69%)、19#(59.92%±0.69%)、20#(58.33%±1.19%)組分對酪氨酸酶單酚酶的抑制活性較高,與陽性對照曲酸(67.86%±0.38%)的抑制率差異不顯著;其余各組分對酪氨酸單酚酶的抑制率均小于50%,抑制活性弱。

以L-多巴為底物進行了薰衣草組分庫50個組分的酪氨酸酶二酚酶抑制活性篩選實驗。薰衣草組分庫中組分對酪氨酸酶二酚酶的抑制活性普遍高于對酪氨酸酶單酚酶的抑制活性。由表3可知,1#～20#組分對酪氨酸酶二酚酶的抑制率幾乎均高于70%,其中16#(94.69%±2.65%)、17#(92.04%±2.34%)、18#(92.04%±0.88%)、19#(92.92%±0.00%)、20#(90.56%±2.55%)組分的酪氨酸酶二酚酶抑制活性比較高,與陽性對照曲酸(92.92%±0.05%)的抑制率差異顯著(p<0.05);21#～50#組分的酪氨酸酶二酚酶抑制率較低,抑制活性弱。其中組分16#～20#對酪氨酸單/二酚酶抑制活性均較優,具有進一步開發研究的潛能。

表3 酪氨酸酶抑制活性測定結果

續表

3 結論

通過薰衣草抗氧化實驗,可以得知組分25#、26#、27#、35#、36#有較高的抗氧化活性,具有成為天然抗氧化劑的潛能;16#、17#、18#、19#、20#組分對膽堿酯酶和酪氨酸酶的抑制活性顯著(p<0.05),有開發成為治療阿爾茨海默癥或皮膚癌等相關疾病藥物的潛能。研究表明,薰衣草含有的揮發油、黃酮、多酚、花色苷等物質具有抗氧化活性,保護神經系統、治療老年癡呆及美白的療效。由此可知,薰衣草提取物具有的抗氧化活性及抑制膽堿酯酶、酪氨酸酶活性可能是多種活性物質共同作用的結果,仍需進一步研究求證。在后續研究中,對于活性較好的組分,綜合運用多種方法,設置多個濃度梯度,進一步更精準的考察、評價其抗氧化及酶抑制活性及相關的物質基礎。