異硫氰酸芐酯及其類似物抑菌活性的初步探究

王 翠,李 萍,朱華平,2,*,李 超,楊強強,隨寶斌

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院,省部共建食品營養與安全重點實驗室,天津 300457;2.中國農村技術開發中心,北京 100045)

異硫氰酸芐酯(Benzyl isothiocyanate)是一種廣泛存在于十字花科蔬菜中的有機硫化合物,由異硫氰酸基團(-N=C=S)、亞甲基和苯環構成,屬于典型的異硫氰酸酯類(Isothiocyanates,ITCs)[1]。ITCs是植物中次級代謝產物硫代葡萄糖苷(Glucosinolate,GS)的酶解產物,十字花科植物在被外力破壞時會激活其細胞內硫代葡萄糖苷酶(芥子酶)的活性,從而使GS水解為ITCs[2]。異硫氰酸芐酯對許多腫瘤系細胞都具有較強的抑制作用,如肝癌[3]、皮膚癌[4]、前列腺癌[5]、乳腺癌[6]等。除此之外,異硫氰酸芐酯具有廣譜抑菌性,如對產氣莢膜梭菌[7]、副溶血性弧菌[8]、空腸彎曲桿菌[9]、大腸桿菌[10]等均有不同程度的抑制活性。

異硫氰酸芐酯常見的結構類似物有異氰酸芐酯、異硫氰酸苯酯、異硫氰酸苯乙酯、異硫氰酸乙酯等(結構見圖1),其中異氰酸芐酯是合成生物素中常用的關環試劑[11],對于優化工藝有重要的意義;異硫氰酸苯酯和異硫氰酸苯乙酯的結構與異硫氰酸芐酯相似,主要差異在于亞甲基的個數不同,具有一定的抑菌性能[8,12];異硫氰酸乙酯也是一種典型的異硫氰酸酯類,但與異硫氰酸芐酯相比缺少苯環,可用于果蔬灰霉病和擴張性青霉感染的防治,在農業及制藥行業中承擔著重要的角色[13]。

圖1 異硫氰酸芐酯及其類似物的結構

國內外對異硫氰酸芐酯的抗癌、抑菌的研究主要集中在其作用機理及其作用范圍方面,對其抑菌活性的相關基團的研究鮮有報道。因此,本研究選取了異硫氰酸芐酯及其常見的4種結構類似物質(異氰酸芐酯、異硫氰酸苯酯、異硫氰酸苯乙酯、異硫氰酸乙酯),通過初步研究其對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)以及革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)抑菌活性,闡明異硫氰酸芐酯的抑菌活性基團及抑菌機理,為異硫氰酸芐酯的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

異氰酸芐酯(98%)、異硫氰酸苯酯(98%)、異硫氰酸苯乙酯(99%)、異硫氰酸乙酯(95%)、異硫氰酸芐酯(98%)、羅丹明123、二甲基亞砜(DMSO) 美國Sigma公司;大腸桿菌ATCC 10305(E.coliATCC 10305)、金黃色葡萄球菌ATCC 25923(S.aureusATCC 25923) 天津科技大學菌種庫;胰蛋白胨、酵母浸取物、瓊脂、葡萄糖 英國OXOID公司;己糖激酶(HK)測試盒、丙酮酸激酶(PK)測試盒、果糖磷酸激酶(PFK)測試盒、超微量總ATP酶測試盒 南京建成生物工程研究所;LB液體培養基:胰蛋白胨2.0 g,酵母膏1.0 g,氯化鈉2.0 g,去離子水200 mL,121 ℃下高壓滅菌15 min,備用;LB固體培養基:胰蛋白胨2.0 g,酵母膏1.0 g,氯化鈉2.0 g,瓊脂3.0 g,去離子水200 mL,121 ℃下滅菌15 min,傾注于無菌培養皿中冷卻,備用;羅丹明123試劑:配制濃度為5 μg/mL,溶劑為DMSO,備用。

酶標儀、熒光分光光度計、搖床、恒溫培養箱 美國Thermo公司;電導率儀 上海雷磁創益儀表有限公司;紫外分光光度計 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抑菌定性實驗 采用打孔法[14]對異硫氰酸芐酯、異氰酸芐酯、異硫氰酸苯酯、異硫氰酸苯乙酯及異硫氰酸乙酯進行抑菌定性實驗。取1 mL濃度為106cfu/mL的菌液均勻涂布于LB固體培養基上,置于無菌操作臺中吹干,打孔器打孔(直徑為6 mm),加入等體積同濃度(均用DMSO配制成20 μg/mL)的5種試劑,DMSO作為陰性對照。最后將培養皿密封后置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h,測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑≥7 mm,則認為該物質具有抑菌性能[15]。

1.2.2 最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)的測定 采用2倍稀釋法[16]對具有抑菌活性的物質測定MIC和MBC。使用96孔板進行實驗,96孔板從左至右分別標記為A1～A12,所用菌液濃度為106cfu/mL。

在A1列中加入160 μL菌液、40 μL抑菌物質(使A1終濃度為8000 μg/L),在A2～A10列內加入100 μL菌液,在A11列中加入100 μL LB培養液作為陰性對照,在A12列中加入100 μL菌液作為陽性對照。從A1中吸取混合液100 μL至A2,再從A2吸取100 μL至A3,依次吸取直至A10,完成2倍稀釋(A1～A10中抑菌物質濃度分別為8000、4000、2000、1000、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 μg/L)。將96孔板置于37 ℃搖床中培養5～6 h后,用酶標儀測定吸光度,確定MIC。在此基礎上,從每孔中取10 μL混合液涂布到LB培養基上,37 ℃培養24 h后,觀察菌落生長情況。未見菌落生長時的抑菌劑最低添加濃度即為MBC。

通過下式計算抑菌率:

注:其中陰性對照為LB的吸光度值,陽性對照為未添加抑菌物質的正常菌液,本實驗中將抑菌率達到60%以上的濃度定義為MIC。

1.2.3 抑菌生長曲線的測定 采用比濁法測定微生物的抑菌生長曲線。取單菌落至LB液體培養基中,搖床(37 ℃,200 r/min)搖菌,以獲取106cfu/mL菌液,在菌液中添加抑菌物質(使抑菌物質終濃度均為抑菌作用最強的抑菌物質的MIC值),搖床(37 ℃,200 r/min)培養12 h,每隔1 h取菌液,于波長600 nm處測定OD值。以時間為橫坐標,以OD600值為縱坐標,繪制抑菌生長曲線。

1.2.4 抑菌機理研究

1.2.4.1 菌體膜電位的測定 使用羅丹明123染色試劑來檢測細菌膜電位的變化[17],以此反映菌體的代謝活力。在106cfu/mL的菌液中加入一定量羅丹明123儲備液,使終濃度為10 μg/mL,搖床培養10 min,以PBS洗菌,重懸于LB培養液中,分管后分別加入不同的抑菌物質(終濃度為各抑菌物質的MIC值),37 ℃搖床搖菌 60 min后檢測其熒光強度,未加入任何抑菌物質的樣品為空白對照。

1.2.4.2 能量代謝相關酶活的測定 利用高壓破壁(大腸桿菌)及反復凍融(金黃色葡萄球菌)的方法對過夜菌液進行破壁處理,獲得粗酶液后用不同抑菌劑處理30 min,按試劑盒相關操作步驟,對處理前后粗酶液中的ATP酶、HK酶、PK酶及PFK酶的酶活進行檢測。

1.3 數據處理

每個實驗均進行3次以上重復,數據由Origin 8.0軟件進行分析,并以平均值±標準偏差表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 抑菌活性基團探究

2.1.1 抑菌定性實驗 由表1、圖2可看出,5種物質對E.coli及S.aureus均具有不同程度的抑菌活性,且S.aureus對抑菌物質更敏感。異硫氰酸芐酯及異氰酸芐酯在固體培養基上產生的抑菌圈較大,其次為異硫氰酸苯酯,但由于本實驗中所用的5種物質均為脂溶性物質,可能會造成在固體培養基上的擴散性不一致,進而會導致其抑菌圈大小與實際抑菌效果強弱的偏差,因此需要在液體培養基中進一步抑菌實驗。

表1 不同物質的抑菌圈直徑(mm)

圖2 大腸桿菌(左圖)和金黃色葡萄球菌(右圖)的抑菌定性實驗

2.1.2 最低抑菌濃度及最小殺菌濃度的測定 表2與表3分別是5種物質對兩種致病菌的MIC及MBC。根據數據的統計分析可知,5種抑菌物質對E.coli和S.aureus均存在較強的抑菌性,但在作用效果上也存在一定的差異。其中,異硫氰酸芐酯、異硫氰酸苯酯以及異硫氰酸乙酯抑菌效果突出,表2中異硫氰酸苯酯對E.coli的MIC為500 μg/L、MBC為2000 μg/L,表3可以看出，異硫氰酸乙酯MIC則為500 μg/L、MBC為1000 μg/L,異硫氰酸芐酯為1000 μg/L、MBC為2000 μg/L;異硫氰酸芐酯以及異硫氰酸苯酯對S.aureus的MIC為500 μg/L、MBC為2000 μg/L,異硫氰酸乙酯MIC則為250 μg/L、MBC為1000 μg/L。整體上,MBC與MIC濃度變化呈現一致性,并且S.aureus對抑菌物質呈現高的敏感性,這與抑菌圈定性實驗的結果相一致。

表2 不同抑菌物質對大腸桿菌的MIC及MBC

表3 不同抑菌物質對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)

2.1.3 抑菌生長曲線的測定 選取抑菌性能最強的抑菌物質(異硫氰酸乙酯)的MIC作為抑菌生長曲線測定中抑菌劑的添加濃度。E.coli的抑菌劑添加濃度為500 μg/L,由圖3可以發現,添加異硫氰酸苯乙酯、異氰酸芐酯以及異硫氰酸芐酯的菌液分別在1、2和3 h出現生長現象,并且在后期生長狀態與原菌液相似,而添加異硫氰酸乙酯與異硫氰酸苯酯的樣品直至實驗結束時,細菌的OD值基本未發生改變;S.aureus抑菌劑添加濃度為250 μg/L。結果表明,添加異硫氰酸苯乙酯的菌液與原菌液基本無差異,添加異氰酸芐酯、異硫氰酸芐酯及異硫氰酸苯酯的菌液分別在2、3以及6 h出現生長現象,添加異硫氰酸乙酯的菌液OD值未發生明顯改變。

圖3 大腸桿菌(左)和金黃色葡萄球菌(右)的抑菌生長曲線

2.1.4 抑菌活性基團的探討 通過對抑菌圈大小、MIC、MBC和抑菌生長曲線的測定,可知異硫氰酸芐酯及4種結構類似物質均具有抑菌性,尤其對S.aureus的抑制作用更強。抑制作用強弱順序依次為異硫氰酸乙酯>異硫氰酸苯酯>異硫氰酸芐酯>異氰酸芐酯>異硫氰酸苯乙酯。

表4 5種物質的結構差異及抑菌活性比較

結合物質結構分析可知,對于R-(CH2)n-NCS結構的異硫氰酸酯類,隨著n值的增加,物質的抑菌活性逐漸減弱,這與王巖等[18]的研究結果相一致;對于缺失苯環的異硫氰酸酯類(如異硫氰酸乙酯)而言,抑菌活性仍然很強,甚至高于異硫氰酸芐酯;對于異硫氰酸基團殘缺但具有苯環的物質(如異氰酸芐酯)抑菌活性明顯降低。因此,可以初步推斷異硫氰酸芐酯的抑菌活性并不是某個基團獨立的作用,而是其苯環、異硫氰酸基團及亞甲基三者協同作用的結果,并且三者中異硫氰酸基團對其抑菌活性的決定性作用最大、亞甲基次之、苯環最弱,且苯環的存在可能對其抑菌作用存在抑制作用。

2.2 抑菌機理初步研究

2.2.1 菌體膜電位的測定 研究表明,異硫氰酸芐酯在發揮抗癌作用時功能相關部位造成影響[19],膜電位能反應細胞代謝活性,因此本實驗中選用了羅丹明123作為熒光指示劑,測定菌體膜電位,結果見圖4。

圖4 5種物質對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞膜電位的影響

圖4表明,抑菌物質處理后的樣品,其熒光強度均發生了不同程度的極顯著(p<00.1)上升,即不同抑菌劑均造成了菌體膜電位的改變,對細菌代謝活性產生了影響,從而抑制了其生長。此外,由圖4可以看出,異氰酸芐酯(具有-N=C=O)作用于菌體后其熒光強度上升最為明顯,這可能是由于氧原子比硫原子更加活潑,因此導致異氰酸芐酯對菌體代謝活性的影響更加顯著;其余4種異硫氰酸酯類抑菌物質中,異硫氰酸乙酯(無苯環)對膜電位的影響較大,同時具有苯環及異硫氰酸基團的3種物質對膜電位的影響較小,這說明苯環的存在可能抑制了抑菌物質對膜電位的影響。

2.2.2 能量代謝相關酶活的測定 ATP酶是一種跨膜的氧化磷酸化途徑關鍵酶,HK酶、PK酶以及PFK酶是糖酵解途徑的3種關鍵酶,這4種酶與菌體的能量代謝息息相關。因此,通過對這4種典型酶類酶活的測定,進一步檢測5種抑菌物質對細菌能量代謝的影響。結果如圖5所示,5種抑菌物質對ATP酶的活性均產生不同程度的抑制作用,其中異氰酸芐酯(-N=C=O)對ATP酶活的影響最為顯著,可使S.aureus中的ATP酶基本失活;異硫氰酸乙酯(無苯環)對ATP酶的作用次之,但比同時具有苯環及異硫氰酸基團的異硫氰酸酯類抑菌物質作用效果強,這與膜電位結果相一致。對于HK酶、PK酶及PFK酶而言,異氰酸芐酯與異硫氰酸乙酯的作用規律呈現一致性,其中異氰酸芐酯作用效果最強,異硫氰酸乙酯次之;在S.aureus中,對于HK酶而言,這種作用效果更強。其余3種同時具有苯環及異硫氰酸基團的異硫氰酸酯類物質對這3種酶的酶活均不造成顯著性影響,這可能與苯環的存在有關。

圖5 5種物質對能量代謝相關酶活的影響

3 結論

異硫氰酸芐酯的抑菌活性并不是某一個基團單獨作用的結果,而是異硫氰酸基團、苯環以及連接它們的亞甲基協同作用的結果,三者中異硫氰酸基團對其抑菌活性的決定性作用最大、亞甲基次之、苯環最弱,甚至對其抑菌活性有一定的抑制作用。結果也表明,5種抑菌物質對細菌的能量代謝均具有影響,且結構不同的抑菌物質對細菌的代謝活性以及相關酶活性的影響不同。其中硫原子被氧原子取代的異氰酸芐酯對菌體膜電位和能量代謝相關酶的影響最大,缺失苯環的異硫氰酸乙酯次之,而具有苯環的3種異硫氰酸酯類物質作用效果更弱,即苯環在其對菌體代謝的影響上存在抑制作用。另外,對能量代謝影響最為明顯的異氰酸芐酯,其抑菌活性并不是最強的,這說明這些基團對菌體很可能還存在其他抑制機理。

異硫氰酸芐酯具有良好的生物活性,在抑菌、抗癌方面具有廣闊的應用前景,本研究中關于其抑菌活性基團以及類似物的研究也將為其進一步應用提供理論依據。