虎杖白藜蘆醇、槲皮素異構體聯用抗生素對耐藥金黃色葡萄球菌的抑制作用

陳尚岳,紀亞明,李玉環,于海霞,謝敬亮,舒揮文,孫穎玲,張妙良,薛喜才,何 羽

(北京小湯山醫院,北京 102211)

耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)是臨床上最常見的病原菌之一,自1961年被發現以來,其耐藥比例逐年上升[1]。由于廣譜抗生素的普遍使用,MRSA目前對苯唑西林、紅霉素、頭孢曲松、頭孢唑林以及β內酞胺類均表現出不同程度的耐藥性,已成為目前現有抗生素難以控制的致病菌之一[2-3],給醫護工作人員造成了極大的困難。因此,尋找新的抑菌策略或藥物對MRSA進行有效的防治成為目前該領域的研究熱點。

MRSA的敏感抗生素主要有萬古霉素、替考拉寧、去甲萬古霉素等,且國內尚未發現耐藥例子;但以上抗生素存在價格昂貴、腎毒性大等缺點,臨床用藥時需謹慎選擇[4]。為了克服以上難題,近年來采用聯合用藥方式對MRSA進行防治取得了良好的效果,如克拉維酸與阿莫西林或替卡西林聯用可有效增強抗生素的抑菌效果[5],萬古霉素聯用苯唑西林對MRSA的殺菌效果可達90%以上等[6],已成為目前MRSA防治的重要手段。然而,多數藥物為抗生素間的聯用,無形間增加了出現新型耐藥菌株的風險,因此,尋找某種既可增強抗生素抑菌作用,又能降低細菌耐藥風險的藥物是目前需要迫切解決的問題。

有報道指出,多酚類化合物中的白藜蘆醇和槲皮素異構體等,可有效地阻礙細菌的外排機制,增強抗生素的抑菌效果[7],且該類化合物通常還具有抗炎,抗過敏,抗真菌,抗微生物和抗氧化等多種藥理學性質[8-10]。為了評估白藜蘆醇、槲皮素異構體與抗生素聯用是否具有增強抗生素的抑菌作用,本文選用虎杖白藜蘆醇、槲皮素異構體與不同抑菌機理的抗生素進行聯合用藥,通過微量稀釋法和K-B擴散法探究聯合用藥的抑菌效果,為多酚類化合物與抗生素的聯合用藥研究提供進一步的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

測試細菌MRSA(MJMC001型) 由第三軍醫大學西南醫院提供;小鼠肺成纖維細胞系的L929細胞株 上海素爾生物科技有限公司;環丙沙星(CIP)、苯唑西林(OXA)、紅霉素(ERY)為抗生素類,槲皮素異構體(MOR)、虎杖白藜蘆醇(RES)為黃酮類藥物,二甲基亞砜(DMSO,100%) 購自美國sigma公司;肉湯培養基(Mueller-Hinton) 上海西寶生物科技股份有限公司;尼龍網 南京建成生物科技有限公司。

高壓蒸汽滅菌鍋(GI54D型) 廈門致微儀器;紫外分光光度計(TU-1901)北京普析;酶標儀(BS～1101型) 美國Bio-Tek;恒溫搖床(HZ250LBG型) 武漢瑞華儀器;Accuri C6流式細胞儀 美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液的配制 將適量MRSA菌株接入肉湯培養基(MH)中進行擴大培養,接種量1%,于150 r/min,37 ℃條件下恒溫培養4 h,當OD600為0.4時(對數生長期),取出菌液稀釋至終濃度為1.0×107CFU/mL備用。

1.2.2 藥液的配制 采用10%(v∶v)的二甲基亞砜(DMSO)溶解藥品,并統一稀釋至5000 mg/L備用。

1.2.3 單藥的最低抑菌濃度測定 最低抑菌濃度(MIC)即抑制細菌生長的最低藥物使用濃度,CIP、OXA、ERY、MOR、和RES單用的MIC采用微量稀釋法測定[11]。在96孔板中,每孔加入180 μL 新鮮MH培養液,后加入10 μL藥液(終濃度為抗生素:50～500 mg/L;多酚類化合物1000～5000 mg/L)和10 μL菌液(約105CFU/mL),空白孔中加入190 μL新鮮MH培養液和10 μL藥液,每組設置三個平行,樣品添加完成后,37 ℃下培養24 h,檢測OD600值(或觀察無菌生長)確定各藥物單用時的MIC。

1.2.4 聯合用藥的抑菌試驗 本實驗通過微量稀釋法和K-B擴散法測定RES、MOR與抗生素聯用的抑菌效果,并與單藥的抑菌效果進行比較。考慮到兩種不同化合物之間可能存在相互作用而最終出現對MRSA不同的抑制作用[12],本實驗將聯合用藥的抑菌作用分為協同、促進、無關和拮抗作用。以抑菌指數(FIC)作為判斷依據,若FIC≤ 0. 5,則為協同作用,當0. 5

1.2.4.1 微量稀釋法 根據Bonapace等[11]的測定方法,在酶標版上,每孔加入180 μL新鮮培養液,5 μL抗生素藥液(使終濃度為1/8 ～ 2 MIC),5 μL的RES、MOR(使終濃度為1/4 ～ 2 MIC)和10 μL菌液(約105CFU/mL),另以20 μL DMSO作為空白對照。37 ℃下培養24 h,檢測OD600值(或無菌生長)確定聯合用藥的MIC(抗生素/RES、MOR)。

1.2.4.2 K-B法 參考Pfaller等[14]的優化方法,根據微量稀釋法所得藥物聯用的MIC,在含有RES或MOR的MH瓊脂平板(90 mm)中,將MRSA菌液均勻地涂抹于平板上,隨后接入無菌紙片,向紙片中加入10 μL抗生素(聯用MIC),另以不加RES或MOR的MH平板作為空白組,37 ℃下培養24 h后,記錄抑制圈直徑(IZD)大小。

1.2.5 聯合用藥的殺菌實驗 參考Bonapace等[11]的實驗方法,在10 mL新鮮MH培養基中,加入組合藥(OXA+RES、OXA+MOR、CIP+RES、CIP+MOR)液100 μL(終濃度為聯用MIC),隨后接入100 μL菌液(終濃度約為105CFU/mL),另以不加任何藥物的MH培養液作為空白對照,以抗生素單用(MIC)作為陰性對照(OXA、CIP),于37 ℃,150 r/min下恒溫搖床培養,分別在0、4、8、12、16和24 h取樣100 μL,以無菌水稀釋至1 mL后,經300目尼龍網過濾,采用流式細胞儀進行活細胞計數,并繪制聯合用藥對MRSA的殺菌曲線。

1.2.6 細胞毒性實驗 本實驗以小鼠肺成纖維細胞系的L929細胞株作為實驗對象,采用MTS法評估有效抑菌藥物組合的細胞毒性[15]。首先將細胞株接種于高糖DMEM培養基中,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養24 h,細胞貼壁生長,繼續孵育5～7 d后以0.25%胰蛋白酶消化傳代。選取對數期的細胞作為實驗對象,并將細胞懸液濃度統一稀釋至1.0×106CFU/mL備用。

在96孔酶標板上每孔接入100 μL細胞懸液(約105CFU/mL),并于5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養24 h 后加藥處理(OXA、OXA+MOR、OXA+RES、CIP、CIP+MOR、CIP+RES),對照組不加任何藥物。繼續培養24 h后加入MTS溶液20μL繼續培養4 h,于490 nm下測定其吸光值(OD值)[16,17],計算細胞存活率[18]。

細胞存活率(%)=(加藥OD值-對照OD值)×100/對照OD值

1.3 數據處理

聯合用藥的抑菌效果采用Oringin 9.0進行擬合分析,殺菌曲線的活菌計數采用Accuri C6軟件(流式細胞儀自帶軟件)進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單藥MIC結果

藥物單用時的MIC如圖1所示,RES和MOR的MIC分別為4500和3000 mg/L,ERY、OXA和CIP的MIC分別為250、200、100 mg/L。根據張芳等[19]和Nakaune等[20]的研究結果,RES可干擾細菌細胞壁合成,抑制細菌代謝的磷酸化水平、NF-xB核轉移和N-FB的相關信號通路,并影響細菌的基因轉運機制,從而達到抑菌效果。MOR的抑菌機理目前還不清楚,但關于槲皮素及其衍生物的抑菌作用,已有相關報道[21-23],且郭艷華等[24]的研究發現,通過化學改性后的槲皮素,不僅克服了其水溶性差等缺點,還增強了其抑菌作用。ERY可與敏感細菌50S核蛋白體亞基可逆性結合,通過抑制核蛋白體受體部位的正常結合,阻礙細菌蛋白質的合成而達到抑菌效果[25]。OXA屬于青霉素類抗生素,主要通過抑制細菌細胞壁的合成而發揮殺菌作用[26]。而CIP作為一種喹諾酮類藥物,是DNA旋轉酶的抑制劑,可作用于細菌的DNA旋轉酶,干擾DNA超螺旋結構的解旋過程,從而阻礙DNA的復制,起到了慢效殺菌的作用[27]。

圖1 單藥的MIC值

2.2 聯合用藥的抑菌效果

聯合用藥的抑菌效果如表1所示。通過K-B法測得藥物單用(MIC)IZD的大小順序為CIP>ERY>OXA>MOR>RES,由微量稀釋法測得ERY聯用RES、MOR的FIC分別為2和1.5,這表明ERY聯用RES或MOR不能增強ERY對MRSA的抑菌作用,且ERY聯用RES的IZD(12.1 mm)與單藥IZD(15.3 mm)相比縮小了26.4%,表現為拮抗效應。這可能是由于ERY與RES發生了某種相互作用,使得有效藥物濃度降低,從而導致ERY對MRSA的抑制作用減弱[28]。然而OXA、CIP與RES、MOR的聯合用藥均可不同程度地增強抗生素對MRSA的抑制作用,抑菌指數為0.5≤ FIC ≤1.0,抗生素的使用量減少了50%～75%,其中CIP聯用MOR的抑菌效果最優,抑菌指數為0.5,CIP用量減少75%,表現為藥物協同作用。這表明RES、MOR均可作為OXA或CIP的增強劑,對抗生素的抑菌作用具有顯著的促進效應(p<0.05)。然而不同的是,三種抗生素聯用RES或MOR的IZD值呈現出高度一致的縮小趨勢,根據魯曉翔[29]的研究發現,雖然多酚類化合物具有廣泛的抑菌活性,但卻不具備專一性,其對MRSA可能是非定向作用,因此最終導致IZD出現縮小的現象。

表1 藥物聯用對MRSA的抑制效果

2.3 聯合用藥的殺菌曲線

OXA聯用RES、MOR的殺菌曲線如圖2所示。當OXA(1/2 MIC)與RES(1/4 MIC)或MOR(1/2 MIC)聯用時,殺菌作用極顯著增強(p<0.01)。在時間為24 h時,OXA單用、OXA聯用RES、OXA聯用MOR的活菌數仍呈現出遞減趨勢,因此,OXA聯合用藥的殺菌強弱順序為:OXA+MOR>OXA+RES>OXA。一般認為,OXA作為一種青霉素類抗生素,主要是抑制MRSA細胞壁合成[19],而RES除可干擾細胞壁合成外,還可影響細菌IxBa磷酸化水平,逆轉細菌的耐藥機制,因此與OXA聯用起到增強殺菌作用的效果。關于MOR的抑菌機理目前尚不清楚。Yoshizumi等[30]的研究發現,槲皮素衍生物可抑制細胞磷脂酰肌醇3-激酶介導的c-Jun N-末端激酶的活性,有利于心血管疾病的治療。但關于MOR是否具有同樣的抑菌機理還有待進一步深入研究。

圖2 苯唑西林聯用白藜蘆醇或槲皮素異構體的殺菌曲線

CIP聯用RES、MOR的殺菌曲線如圖3所示,CIP作為一種慢效殺菌的喹諾酮類抗生素,RES或MOR聯用時,其殺菌效果顯著增強,活菌數量下降明顯。在24 h時,CIP單用(MIC)、CIP聯用RES、CIP聯用MOR條件下的活菌數亦呈現遞減趨勢,其殺菌強弱順序為:CIP+MOR>CIP+RES>CIP。由于RES可抑制細胞壁的合成,影響細胞膜的信號轉導和通透性[31],因此RES與CIP聯用時,CIP作用于MRSA胞內的藥物濃度加大,因此對MRSA胞內DNA活動的抑制作用增強,從而導致殺菌效果的顯著提升,這與宋曉言等[32]研究30 味中藥提取物與CIP聯用對豬源鏈球菌的體外抑菌結果相類似。然而,關于MOR對CIP的增強效應及其抑菌機理還有待深入研究。

圖3 環丙沙星聯用白藜蘆醇、槲皮素異構體的殺菌曲線

2.4 細胞毒性研究結果

有效抑菌藥物組合的細胞毒性試驗結果如圖4所示。OXA或CIP單用時,小鼠細胞的存活率分別為93.8%和94.5%,這表明兩種抗生素對小鼠細胞均具有輕微細胞毒性,然而OXA聯用RES和CIP聯用RES的細胞存活率分別為95.3%和96.1%,因此,RES與兩種抗生素的聯合用藥均不會增加對小鼠纖維細胞的毒性作用,且細胞存活率有所上升。這可能與RES本身所具有的抗氧化、清除氧自由基等藥理學特性有關[33]。而當MOR與OXA或CIP聯用時,細胞存活率與抗生素單用相比分別降低了8.9%和7.2%,這表明MOR與兩種抗生素的聯用呈現出微弱細胞毒性增加的現象。根據Hou等[34]的研究發現,MOR在大鼠體內的藥代動力學與槲皮素相比具有較大差異,藥物殘留濃度較高,因此對細胞具有一定的毒性作用。然而,Ferry等[35]研究認為,MOR對人體細胞的毒性有限,與抗生素藥物聯用時不會引起細胞的損傷或凋亡。因此,關于MOR的細胞毒性機理還需要進行后續研究。

圖4 有效抑菌藥物組合的細胞毒性

3 結論

本文旨在探究聯合用藥對MRSA的抑制作用,并尋找新的抑菌藥物組合或抗生素增強劑。通過微量稀釋法發現虎杖白藜蘆醇和槲皮素異構體對MRSA均具有天然抑菌活性,其MIC分別為4500和3000 mg/L。藥物聯用的實驗結果表明紅霉素聯用虎杖白藜蘆醇或槲皮素異構體均不能增強抗生素對MRSA的抑制作用,表現為無關或拮抗效應。而苯唑西林或環丙沙星與虎杖白藜蘆醇、槲皮素異構體聯合用藥均可增強對MRSA的抑菌作用,抗生素使用量與單藥相比降低了50%～75%,其中最佳抑菌組合為環丙沙星聯用槲皮素異構體,聯用MIC為環丙沙星25 mg/L,槲皮素異構體750 mg/L,抑菌指數(FIC)為0.5,表現為藥物協同作用。

有效的抑菌藥物組合細胞毒性實驗結果表明,虎杖白藜蘆醇與苯唑西林或環丙沙星的聯合用藥均不會增加對小鼠L929細胞的毒性作用。而槲皮素異構體聯用苯唑西林或環丙沙星時,小鼠L929細胞存活率與抗生素單用相比分別降低了8.9%和7.2%,這表明槲皮素異構體與兩種抗生素的聯用對小鼠的細胞毒性有所增加。本文為進一步研究白藜蘆醇、槲皮素異構體聯用抗生素的抑菌作用和抑菌機理奠定了基礎。