植物乳桿菌細菌素基因plnEF的克隆與異源表達

阮曉莉,冉軍艦,趙瑞香,*,李 剛,雷 爽,ZHU Yang

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003;2.瓦赫寧根大學研究中心，格爾德蘭瓦赫寧根 5960AA)

細菌素是指某些細菌在代謝過程中產生的一類抗菌性的多肽、蛋白質或蛋白質復合物[1],能夠有效抑制或殺滅致病菌和腐敗菌,近緣菌種產生的細菌素會呈現出較為狹窄的抑菌圈[2]。細菌素相較于抗生素更加高效,且在實際應用中無毒副作用和耐藥性,某些產生菌在發酵過程中還能起到一定的保健作用,因此將細菌素應用在食品領域中的前景可觀[3-4]。目前細菌素主要應用于分子生物學領域，研制開發能夠代替醫療保健劑的產品,雖然細菌素的種類繁多,但是在食品防腐劑方面應用較少[5]。迄今為止僅有一種羊毛硫細菌素Nisin被世界上六十多個國家允許使用在食品防腐方面,絕大多數的細菌素尚在試驗階段,主要是因為化學合成的細菌素成本高、性質不穩定而且天然細菌素的產量比較低,難以純化進行商業化生產,因此通過基因重組技術以期獲得大量純度較高的細菌素并將其應用到實際當中顯得尤為重要[6-7]。

細菌素分為四類:Ⅰ類為羊毛硫抗生素,Ⅱ類為含有非修飾氨基酸的多肽,Ⅲ類為大分子蛋白質,Ⅳ類為蛋白質復合物[8]。Ⅱ類細菌素被分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc和Ⅱd四個亞類,其中研究較為深入的是Ⅱa類細菌素[9-10],但是其作為異源表達的對象時，最終獲得的抗菌性蛋白活性差異顯著,究其原因主要是Ⅱa類單肽鏈非修飾抗菌肽對宿主細胞產生一定的毒性作用[11],經多年來研究人員對細菌素遺傳學的深入研究發現，將Ⅱb類細菌素進行異源表達可以克服毒害宿主細胞的問題[12]。乳酸菌作為世界上廣泛應用的益生菌,目前對于其產生的Ⅱb類細菌素的研究相對較少,植物乳桿菌素PlnEF屬于Ⅱb類雙肽鏈非修飾細菌素,但天然的細菌素PlnEF不僅產量低而且難以分離純化,最實用、高效率的方法就是通過基因工程來解決此類難題。

表達質粒pET含有強啟動子使其具有強大的表達功能,并且本身攜帶6個組氨酸的His單抗標簽,使融合蛋白能夠得到較好地鑒定與純化[13]。大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)因其多方面的優越性多年來廣泛應用于生物工程領域,其作為表達菌株具有清楚的遺傳背景、培養條件簡單、價格低廉且外源表達水平遠高于其他宿主細胞等優點,所以常作為生物技術研究的首選表達體系[14]。早在2004年,Park等[15]將導入有植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)谷氨酸脫羧酶基因的大腸桿菌進行誘導表達,獲得了重組谷氨酸脫羧酶蛋白的高效表達,并證實該蛋白具有活性。龔鋼明等[16]將乳桿菌中亞硝酸鹽還原酶基因連接質粒pET-32a(+)構建表達載體,并成功導入受體細胞大腸桿菌中,使其大量克隆后表達的蛋白達到預期的生物特性。植物乳桿菌含有產生細菌素的基因,可依據植物乳桿菌抗菌特性探究其作為生物防腐劑的潛力[17]。對于表達系統的鑒定,比較常用的方法是將工程菌菌落通過PCR擴增目的基因,確定目的基因是否成功導入質粒載體,若想進一步驗證原核表達質粒是否構建成功,可提取重組質粒進行雙酶切鑒定,并將鑒定結果呈陽性的重組質粒送入測序公司測序。不少研究者在此類分子生物學研究中采用了上述鑒定方法[18-20]。

本研究采用基因工程技術,在大腸桿菌BL21中導入重組質粒pET-28a-PL-plnEF構建工程菌表達抗菌性蛋白,經鎳柱純化以期獲取細菌素的高效表達,對深入探究植物乳桿菌細菌素的生物特性以及開發其作為食品防腐劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) 從水開菲爾分離并于實驗室保藏;表達質粒pET-28a(+)、指示菌株大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)、大腸桿菌BL21(EscherichiacoliBL21) 由河南科技學院生物技術試驗室保存;SOB(Super Optimal Broth)培養基 海博生物技術有限公司;MRS(Man-Rogosa-Sharpe)、LB(Luria-Bertani)培養基 所用試劑均為國產分析純;SanPrep柱式質粒DNA抽提試劑盒 生工生物工程股份有限公司;膠回收試劑盒 OMEGA公司;Prestained DL 15000 DNA Marker、Prestained DL 2000 DNA Marker、2×Power Taq PCR MasterMix 北京百泰克生物技術有限公司;HisTrap HP親和色譜柱 GE Healthcare公司;基因組DNA的小量純化試劑盒、T4 DNA Ligase Buffer、限制性核酸內切酶Xho I、Noc I、Premixed Protein Marker(Low) 日本TaKaRa公司。

VCX130超聲波細胞破碎儀 美國SONICS公司;PCR擴增儀 Long Genes Instruments;ZHYW-211C恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;Sigma3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司;GelX1650凝膠成像儀 上海歐翔科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒的構建及異源導入

1.2.1.1 菌株的培養及DNA提取 取超低溫冰箱保存的植物乳桿菌菌種在平板中劃線,挑取單菌落于MRS液體培養基中37 ℃培養24 h,按1%的接種量于培養基中培養18 h作為種子液。使用TAKARA基因組DNA的小量純化試劑盒提取植物乳桿菌基因組DNA。

1.2.1.2 植物乳桿菌素plnEF基因擴增 根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)中報道的plnEF(432 bp)基因片段,選擇限制性核酸內切酶Xho I、Noc I作為目的基因plnEF片段5′端和3′端的內切酶位點,在pET-28a(+)質粒本身攜帶的His標簽單抗,構建含有6個組氨酸標簽的表達載體,蛋白優化表達后可得到純度較高的細菌素。

根據目的基因序列利用prime5.0在線軟件設計引物,由武漢金凱瑞生物有限公司合成,堿基序列如下:前端引物plnEF-F(Xho I):5′-ATGCCTCGAGT GGGCATAGTTAAAA-3′;后端引物plnEF-R(Noc I):5′-TATGGATTCTCAGGTTGCCGCAAAA-3′,質粒克隆位點如圖1。

圖1 質粒pET-28a(+)克隆位點圖

以供體菌株植物乳桿菌中全基因組為模板,PCR擴增目的基因,隨后采用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物[21]。反應條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性、55 ℃退火、72 ℃延伸各30 s,30個循環[22]。

1.2.1.3 純化目的基因 PCR擴增產物中含有少量引物二聚體,需要將DNA進行膠回收[23],目的在于分離這些基因片段,將凝膠中目的基因所在的區域切膠回收其中的基因片段,以達到純化目的基因的目的。膠回收后的樣品用1%的瓊脂糖凝膠驗證目的基因是否已回收到及其片段大小是否正確。

1.2.1.4 構建表達載體 將純化后的目的基因與提取出的pET-28a(+)質粒分別用限制性核酸內切酶Xho I、Noc I在保溫儀中37 ℃雙酶切3 h并驗證[24]。酶切體系:10×QuickCut Green Buffer 5 μL;限制性核酸內切酶Noc I、Xho I各1 μL;質粒pET-28a(+)15 μL;加雙蒸水至50 μL。雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳驗證分子量大小。將目的基因利用T4 DNA連接酶連接至質粒并命名為pET-28a-PL-plnEF。

利用電穿孔儀選擇Bacteria模式Ecl2(2.49 kv,5.9 ms),將表達載體pET-28a-PL-plnEF導入感受態大腸桿菌BL21并迅速加入1 mL SOB培養基,培養1 h后菌液高速離心余留150 μL培養基用于重懸菌體,涂于預熱好的含Kana抗生素的LB平板[25]。

1.2.1.5 BL21-pET-28a-PL-plnEF重組菌株鑒定 12 h后培養完成的LB平板上出現白色菌落,為了確認目的片段已成功轉化到宿主細胞BL21中,需要選擇陽性單菌進行PCR鑒定,此時所用引物無限制性酶切位點,反應條件參照1.2.1.2。

1.2.2 融合蛋白表達及驗證

1.2.2.1 融合蛋白的表達及提取 為驗證目的蛋白是由目的基因plnEF轉錄而成的,需要將空白質粒電轉化大腸桿菌作為對照。同時對成功構建的工程菌BL21-pET-28a-PL-plnEF和對照組BL21-pET-28a誘導表達[23-24]。即在500 mL培養基中按1∶1000加入50 mg/mL Kana,分別將兩種工程菌以1%的比例轉接至培養基,繼續37 ℃振蕩培養5 h后加入IPTG,IPTG作為誘導劑能夠啟動基因發生轉錄,在30 ℃條件下誘導反應12 h。若菌量比較少可以將菌液離心濃縮至兩管棄除上清液,按比例1∶20加入ddH2O重懸菌體,超聲破法處理菌液(超聲條件:300 W,時間6 min,超聲破碎3 s,停歇4 s,50個循環),取上清液再次離心用0.22 μm濾膜去除雜質,濾液收集用于SDS-PAGE蛋白驗證。

1.2.2.2 融合蛋白的親和純化及鑒定 將1 mL HisTrap HP純化介質裝柱,上方安裝0.22 μm的濾膜,首先用注射器取1 mL的蒸餾水緩慢流洗鎳柱10遍,其次用濃度為10 mmol/L的咪唑(imidazole buffer with saline,IBS)緩沖溶液沖洗十遍以上,以便將柱子中容易揮發的雜質沖洗出來以達到平衡柱子的目的。將工程菌表達后得到的粗提液蛋白上樣于His Trap HP 2至3次,分別用1 mL 10、20、50、100、200、300、400、500 mmol/L咪唑洗脫蛋白,由預實驗可知,50 mmol/L咪唑可洗脫目的融合蛋白,對照組所得蛋白用50 mmol/L咪唑。SDS-PAGE(15%分離膠、5%濃縮膠)電泳鑒定。

1.2.3 抑菌性試驗 為確定目的抗菌性蛋白的洗脫梯度及抑菌效力,以大腸桿菌JM109為指示菌株進行抑菌性試驗。牛津杯法在LB平板中打孔,分別取工程菌BL21-pET-28a-PL-plnEF和對照組工程菌BL21-pET-28a預留的培養基上清液以及不同濃度的咪唑緩沖液沖洗出的蛋白濾液各100 μL加至孔中,正置于恒溫培養箱中37 ℃培養,每組做3個平行試驗。

為確定目的抗菌性蛋白的洗脫梯度及抑菌效力,以大腸桿菌JM109為指示菌株進行抑菌性試驗。牛津杯法在LB平板中打孔,分別取工程菌BL21-pET-28a-PL-plnEF預留的培養基上清液、不同濃度的咪唑緩沖液沖洗出的蛋白濾液以及對照組工程菌BL21-pET-28a用50 mmol/L咪唑洗脫的蛋白濾液各100 μL加至孔中,正置于恒溫培養箱中37 ℃培養,每組做3個平行試驗。

1.3 數據處理

每組試驗進行三次重復,試驗結果用平均值±標準偏差顯示,采用SPSS(18.0)軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建及異源導入

2.1.1 膠回收目的基因驗證 如圖2所示,PCR擴增產物經膠回收后已完全去除引物二聚體形成的非目的條帶,達到純化的目的。

圖2 膠回收目的基因驗證結果

2.1.2 雙酶切目的基因、pET-28a(+)以及酶連產物驗證 雙酶切目的基因僅切掉6個保護堿基,驗證結果如圖3。一般試劑盒提取出的質粒呈高度折疊狀態,需要經過酶切后再進行電泳,以確定質粒的實際大小。已知表達質粒分子量為5369 bp,質粒經限制性核酸內切酶Xho I、Noc I切掉132 bp,瓊脂糖電泳結果如圖4顯示,質粒分子量大小無明顯變化,在大約5000 bp的位置出現唯一且明顯的條帶,證明質粒雙酶切成功。

圖3 雙酶切目的基因驗證結果

圖4 雙酶切質粒pET-28a(+)驗證結果

連接產物驗證結果如圖5,可明顯看到近6000 bp有一條帶,與預期酶連產物分子大小相符。

圖5 酶連產物驗證結果

2.1.3 原核重組表達質粒的鑒定 重組質粒菌落PCR擴增后經瓊脂糖凝膠電泳驗證,結果如圖6所示,出現唯一且較為明顯的目標條帶,條帶位置預期值與目的基因plnEF426 bp大小相符,表明重組質粒PCR擴增效果良好,初步證明目的基因plnEF已整合到質粒pET-28a(+)中[26-27],測序結果與plnEF序列一致。

圖6 菌落PCR鑒定

2.2 目的融合蛋白的純化

工程菌菌液采用超聲破碎法破碎細胞,釋放目的融合蛋白,高速離心獲得粗提液蛋白。經不同濃度的咪唑鎳柱純化,收集洗脫蛋白進行SDS-PAGE電泳鑒定[28-29]。染色3 h脫色后,50 mmol/L咪唑溶液洗脫后呈現出一條分子量在14.3～20.1 kDa之間的蛋白條帶,基本與理論融合蛋白分子量15.6 kDa大小相符(圖7)。空白對照在50 mmol/L咪唑洗脫時沒有此蛋白條帶,表明該融合蛋白應為目的蛋白,且能夠在50 mmol/L咪唑濃度下得到有效溶解,純化效果較好。

圖7 BL21-pET28a-PL-plnEF及對照組誘導表達結果

2.3 抑菌性試驗

如圖8所示,LB平板上出現明顯大小不同的抑菌圈,指示菌株濃度一定,抑菌圈大小與抗菌蛋白的抑菌效力有關,依據平行實驗,平板中1至11抑菌圈平均直徑如表1所示。其中3號即50 mmol/L咪唑洗脫的目的融合蛋白抑菌效果最為明顯,說明目的融合蛋白具有抗菌作用。由抑菌圈11可明顯看出50 mmol/L咪唑洗脫下的對照組工程菌蛋白沒有抑菌能力,且通過SDS-PAGE電泳結果泳道3和10對比得出,對照組工程菌BL21-pET-28a沒有產生50 mmol/L濃度的咪唑能夠有效洗脫的蛋白。結合SDS-PAGE電泳蛋白表達結果以及抑菌性試驗分析可知,確定50 mmol/L的咪唑洗脫的融合蛋白,即為目的基因plnEF所表達的目的蛋白,且該蛋白具有較高的抑菌活性[30]。

圖8 BL21-pET-28a-PL-plnEF蛋白及對照組蛋白抑菌性圖

表1 抑菌試驗中各抑菌圈直徑平均值

3 結論

本實驗中菌落直接PCR鑒定后將重組質粒測序,不僅能降低實驗成本,大大縮短試驗時間,而且減少了實驗操作中各種因試劑殘留對分子鑒定帶來的不利影響。在本實驗中工程菌按1%的接種量僅培養5 h進行IPTG誘導,蛋白獲得高效表達,但不同誘導條件對重組融合蛋白的表達有很大影響。在本試驗中若想使重組融合蛋白最大程度的表達,需要對誘導劑在不同誘導時間、誘導環境、誘導濃度等條件下做進一步的研究。

理論目的蛋白條帶為15.6 kDa,與SDS-PAGE電泳鑒定結果相符。通過抑菌試驗結果可以明顯觀察到濃度為50 mmol/L的咪唑能有效洗脫該工程菌所表達的蛋白且該蛋白抑菌作用較強,工程菌發酵上清液具有明顯抑菌效果,說明發酵上清液中同樣含有該目的抗菌蛋白,依據抑菌圈直徑大小表明,50 mmol/L咪唑洗脫下來的目的蛋白與其發酵上清液相比抗菌效力更強,本試驗中的目的融合蛋白是以可溶性表達的形式在工程菌中進行高效表達,表明該蛋白對宿主細胞BL21沒有毒害作用。基于抑菌試驗對該蛋白的抑菌性檢測,植物乳桿菌plnEF基因片段編碼的多肽能夠在原核細胞中正確表達,能夠作為潛在的食品生物防腐劑,可在不同條件下研究其抑菌活性和特性,將成為進一步研究的方向。