雙孢蘑菇蛋白的提取工藝優化及其功能性質

鄭新雷,李靈誠,滕建文,韋保耀,黃 麗,夏 寧,覃柳迪

(廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

食用菌是一類營養豐富,可供人類食用的大型真菌的總稱。雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)屬傘菌科蘑菇屬,是食用菌中的大宗品種,別名白蘑菇、圓蘑菇、西洋蘑菇,是一種在全球都廣泛栽培的食用菌,產量占食用菌總量的70%[1]。我國雙孢蘑菇主要用作鮮食,精深加工產品較少[2]。因此,需要進一步開發雙孢蘑菇精深加工系列產品,開拓雙孢蘑菇產品市場。

目前對雙孢蘑菇的研究主要集中在雙孢蘑菇的褐變抑制和多糖的活性研究上,大量的藥理和臨床研究表明雙孢蘑菇多糖具有抗氧化、免疫調節、抗腫瘤、抗癌、降血糖、降血脂等生物活性[3-5]。但對蛋白的研究卻較少。而雙孢蘑菇干物質中蛋白含量約為32.88%～37.86%,其中含有大量具有生物活性的蛋白和肽類物質等[6-7]。而目前對雙孢蘑菇蛋白的研究中,主要側重于蛋白的提取與營養活性的研究[8]。雙孢蘑菇蛋白提取方法有堿溶酸沉法、酶法、物理法。綜合比較,酶法和物理法提取得到的雙孢蘑菇中蛋白的回收率與純度均較低[9]。在前人的研究基礎上發現雙孢蘑菇蛋白具有一定的抗氧化活性、抗菌性[9-10]。但是對雙孢蘑菇蛋白功能性質缺乏研究。

因此,本研究以雙孢蘑菇為原料,采用傳統的堿溶酸沉方法提取雙孢蘑菇蛋白,采用響應面法優化蛋白提取條件,并進行蛋白的氨基酸組成分析,得到具有較高營養價值的雙孢蘑菇蛋白制品,同時對雙孢蘑菇蛋白的功能性質進行了初步研究,為工業制備雙孢蘑菇蛋白制品及其應用提供初步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雙孢蘑菇(Agaricusbisporus) 購于南寧五里亭批發市場;MD44透析袋(8000～14000 Da)、牛血清白蛋白、Folin-Phenol 購于北京索萊寶科技有限公司;鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、磷酸、碳酸鈉、苯酚、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

Beta 1-8Lsc plus真空冷凍干燥機 德國CHRIST儀器有限公司;EL20數顯pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司;TLE204E/02分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;S25磁力攪拌機 德國 IKA 公司;UV-1601紫外可見分光光度計 日本島津公司;ST16R高速冷凍離心機 美國熱電公司;SKD-600凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司;L-8900高速氨基酸分析儀 日本HITACHI公司;T25高速均質機 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙孢蘑菇蛋白的制備 將新鮮雙孢蘑菇進行褐變抑制處理。每次取5 kg置于密閉空間中,燃燒3 g硫磺,熏蒸30 min,熏蒸完畢后置于陰涼處放置2～3 h以清除果實周邊多余的SO2氣體[11]。將雙孢蘑菇與蒸餾水按照一定的料液比(W/V)進行打漿,利用2 mol/L NaOH或者2 mol/L HCl調節至一定的pH,在一定的溫度下提取一定的時間。提取完成后,4 ℃、8000 r/min離心20 min后得到上清液和不溶物。上清液用2 mol/L的HCl調節pH為4.3,4 ℃靜置一夜,8000 r/min離心20 min,用去離子水洗沉淀3次,接著用2 mol/L NaOH調節pH至7.0,使其充分溶解后,用去離子水在4 ℃下用透析袋透析24 h,冷凍干燥得到雙孢蘑菇蛋白[12]。

1.2.2 單因素實驗 采用1.2.1的方法提取雙孢蘑菇蛋白,以雙孢蘑菇蛋白的提取率為考察指標,分別對料液比(W/V)、pH、提取溫度、提取時間4個影響提取率的因素進行考察。固定提取溫度30 ℃,提取時間2.0 h,提取液pH10.0,考察不同料液比(W/V)(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)對蛋白提取率的影響;固定料液比(W/V)1∶3,提取溫度30 ℃,提取時間2.0 h,考察不同pH(5、6、7、8、9、10、11)對蛋白提取率的影響;固定料液比(W/V)1∶3,提取溫度30 ℃,提取液pH10.0,考察不同提取時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)對蛋白提取率的影響;固定料液比(W/V)1∶3,提取液pH10.0,提取時間2.0 h,考察不同提取溫度(20、30、40、50、60 ℃)對蛋白提取率的影響。

1.2.3 響應面設計 在單因素的基礎上,以提取時間、提取溫度、pH為實驗因素,以雙孢蘑菇蛋白提取率為響應值,采用響應面分析軟件Design-Expert 8.05建立三因素三水平的Central Composite模型,通過試驗確定最優提取工藝。變量因素編碼及水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計

1.2.4 蛋白含量及純度測定 原料中蛋白質及純度測定采用國標GB 5009.5-2016中“凱氏定氮法”測定;提取得到的上清液中蛋白的測量方法Lowry法測定[13]。采用Lowry法測定上清液蛋白含量,其標準曲線為y=0.2552x+0.0847,其R2值為0.9994。

1.2.5 氨基酸分析 使用氨基酸分析儀進行氨基酸分析測定。取一定量最佳工藝條件下制備的蛋白樣品加入8 mL 6 mol/L的HCl 溶液中,置于10 mL具塞消解管中,密封。在110 ℃鼓風干燥箱中消解22 h,每隔一段時間混勻一下水解液。將消解后的樣品溶液過濾并定容至50 mL棕色容量瓶中。準確吸取1.0 mL濾液移入到15 mL試管內,蒸發濃縮干燥,干燥后殘留物用1～2 mL水溶解,再繼續干燥至最后蒸干。用1.0～2.0 mL pH2.2檸檬酸鈉緩沖溶液加入到干燥后試管內溶解,振蕩混勻后,吸取溶液通過0.22 μm濾膜后,轉移至儀器進樣瓶,為樣品測定液,供儀器測定用[14]。

1.2.6 雙孢蘑菇蛋白的功能性研究

1.2.6.1 不同pH下雙孢蘑菇蛋白的溶解度測定 稱取100 mg最佳工藝條件下制備的蛋白樣品加入10 mL的去離子水中,室溫下磁力攪拌30 min。在攪拌過程中用2 mol/L HCl與2 mol/L NaOH溶液分別調溶液pH為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。攪拌30 min后于10000 r/min離心30 min,以牛血清白蛋白(BSA)為標準物,采用Lowry法測定上清液中的蛋白含量[15],其標準曲線為y=0.2552x+0.0847,其R2值為0.9994。每個樣品測定三次。

蛋白溶解度(%)=(上清液中的蛋白質量/樣品蛋白質量)×100

1.2.6.2 雙孢蘑菇蛋白的起泡性 配制1%(W/V)最佳工藝條件下制備的雙孢蘑菇蛋白溶液100 mL,用均質機5000 r/min均質2 min,快速移至100 mL的量筒,記錄泡沫所占的體積,記為V0;將量筒于30 ℃水浴鍋30 min,記錄泡沫的殘留體積(Vr)。同時以大豆分離蛋白做對照。V0用以評估蛋白溶液起泡能力大小,V0與Vr可用于計算泡沫穩定性[16]。

發泡能力(%)=(V0/V)×100

泡沫穩定性(%)=(Vr/V0)×100

其中,V:蛋白溶液的初始體積,本實驗為100 mL。

1.2.6.3 雙孢蘑菇蛋白的持水性 配制20 mL 1%(W/V)的最佳工藝條件下制備的雙孢蘑菇蛋白溶液,吸取5 mL溶液,移入已稱重的10 mL離心管中,5000 r/min離心30 min,小心地除去上清液,稱量此時離心管的質量[17]。同時以大豆分離蛋白做對照。按以下公式計算出雙孢蘑菇蛋白的持水能力(WHC):

WHC(%)=(m2-m1)/m×100

其中,m1:離心管的質量,g;m2:去除上清液后離心管的質量,g;m:離心管中蛋白的質量,g。

1.2.6.4 雙孢蘑菇蛋白的持油性 稱取0.5 g最佳工藝條件下制備的雙孢蘑菇蛋白,加入5 mL食用油,混合均勻后,5000 r/min離心30 min,小心地除去上層油,稱量此時離心管的質量[18]。同時以大豆分離蛋白做對照。按以下公式計算出雙孢蘑菇蛋白的持油能力(OHC):

OHC(%)=(m2-m1)/m×100

其中,m1:離心管的質量,g;m2:去除上層油后離心管的質量,g;m:離心管中蛋白的質量,g。

1.2.6.5 雙孢蘑菇蛋白的乳性與乳化穩定性測定 配制0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液,調節其pH為7.0,取一定量最佳工藝條件下制備的蛋白樣品配制成質量濃度為0.1 g/L的蛋白溶液,將色拉油與待測溶液1∶1混合后于均質機中10000 r/min均質1 min,立即用微量取樣器從底部取50 μL,用質量濃度為0.1 g/L SDS的相同緩沖液稀釋成5 mL,混合后立即用分光光度計以0.1 g/L SDS為對照,在500 nm波長下測定吸光值A0。10 min后再取50 μL,用含0.1 g/L SDS的相同緩沖液稀釋成5 mL,搖勻后立即用紫外分光光度計在500 nm波長下測定吸光值A10。同時以大豆分離蛋白做對照[19-20]。

其中,T=2.303;C:乳化液形成前蛋白水溶液中蛋白濃度(g/mL);ψ:乳化液中油的體積分數;D:稀釋倍數。

1.3 數據處理

所有實驗均重復三次,采用IBM SPSS Statistics 20進行數據處理,Oringin 8.6軟件作圖,Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對雙孢蘑菇蛋白提取率的影響 從圖1可以看出,料液比的增加會提高雙孢蘑菇蛋白的提取率,當料液比為1∶3時,提取率顯著(p<0.05)增加到56.09%,隨后蛋白提取率增加緩慢。這可能是由于雙孢蘑菇中含有纖維等大分子物質,隨著溶劑體積的增加,原來聚集并可能纏繞在一起的大分子吸水溶脹后逐漸展開,將包裹在內部的蛋白暴露出來,使得蛋白溶出,當料液比增加到一定比例,兩相體系接觸程度最大化,因此提取率變化趨于平緩[21]。所以從經濟和實際考慮,選擇提取雙孢蘑菇蛋白的最佳料液比為1∶3。在響應面設計時不再考慮料液比的因素。

圖1 料液比對雙孢蘑菇蛋白提取率的影響

2.1.2 不同提取pH對雙孢蘑菇蛋白提取率的影響 從圖2可以看出,雙孢蘑菇蛋白提取率先隨著提取液pH的增加而增加,后趨于平緩并略有下降,在pH為10時,回收率最大為56.97%。一方面可能是因為隨著pH的增加,使得蛋白分子間的氫鍵被打破,從而使得蛋白更好的溶出;另一方面可能是纖維的裂解導致蛋白溶出。但是堿性過強會使得蛋白變性,使得蛋白的溶解性下降,上清液中蛋白含量降低[12]。所以設定雙孢蘑菇蛋白的最佳提取液pH為10.0。

圖2 pH對雙孢蘑菇蛋白提取率的影響

2.1.3 提取時間對雙孢蘑菇蛋白提取率的影響 從圖3可以看出,隨著提取時間的增加,雙孢蘑菇蛋白的提取率先增加后減少,在提取時間為2.5 h時達到最大值56.21%。根據化學反應速度和化學平衡理論,蛋白在某種溶劑中的溶解過程并非離子化合物的電離,而是大分子化合物中某些基團與溶劑發生溶劑化作用而被逐漸溶脹、絡合、分散、溶合,經歷若干過程,速度緩慢,需要一定時間才能達到平衡狀態[22]。因此提取時間過短,蛋白質從原料中溶解不完全。但隨著提取時間的延長,蛋白質溶出量達到飽和,因此繼續延長提取時間,蛋白提取率不再有明顯的增加[23]。因此雙孢蘑菇蛋白的最佳提取時間為2.5 h。

圖3 提取時間對雙孢蘑菇蛋白提取率的影響

2.1.4 提取溫度對雙孢蘑菇蛋白提取率的影響 從圖4可以看出,隨著提取溫度的增加,雙孢蘑菇蛋白的提取率先增大后減少,并在50 ℃時達到最大值58.10%。這可能是因為升高溫度使蛋白分子空間構象改變,立體結構適當伸展,加強了水分子和蛋白分子之間的相互作用,蛋白溶解度增加,有利于蛋白的析出。而溫度過高的話可能會導致蛋白的變性。升高溫度,分子間運動加劇使維持蛋白空間構象和立體結構的弱作用力消失,一些非極性的基團暴露在分子表面,影響蛋白和水分子之間的相互作用,蛋白溶解度降低,從而導致提取率降低[24]。因此選擇提取雙孢蘑菇蛋白的最佳提取溫度值為50 ℃。

圖4 提取溫度對雙孢蘑菇蛋白提取率的影響

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立與顯著性分析 蛋白提取率響應面實驗結果如表2所示。

表2 蛋白提取率響應面實驗結果

利用Design Expert軟件對表2的實驗數據進行擬合,得到提取率的二次多項回歸模型為:

雙孢蘑菇蛋白提取率Y=-263.75881+42.12188A+1.39756B+58.42250C-0.065000AB-1.71250AC-0.071500BC-1.71394A2-4.98313×10-3B2-7.32300C2,對模型進行方差分析和回歸模型系數顯著性分析,結果如表3所示:

表3 蛋白提取率的方差分析與回歸分析結果

利用Dinsign-expert 7.0軟件做出交互作用3D曲面圖。從圖5可以看出,AB、AC響應面的坡度較陡,等高線密集成橢圓形,說明AB、AC兩兩交互作用對響應值的影響顯著(p<0.01和p<0.05),而BC的曲面比較平緩,等高線稀疏,則說明其對響應值的影響不大。

圖5 兩因素的交互作用圖

2.2.2 響應面優化最佳條件的驗證 對二次多項回歸模型中的三個因素分別求導,以提取率最大值作為優化標準,得到最優水平組合為提取液pH為9.93,提取時間2.55 h,提取溫度為57.18 ℃,理論提取率59.79%;根據實際情況選用pH為9.9,提取時間2.6 h,提取溫度為57 ℃,作為實驗條件進行驗證,得到實際提取率:60.29%±0.19%,此時蛋白純度為72.70%±0.38%。經SPSS軟件顯著性分析,實際蛋白提取率與理論值差異不顯著(p>0.05),因此證明該模型能很好地預測實驗結果。

2.3 雙孢蘑菇蛋白氨基酸分析

蛋白中氨基酸種類齊全且符合FAO/WHO的氨基酸模式標準,則表示此蛋白營養價值較高,適合人體生理需求[25]。雙孢蘑菇以及雙孢蘑菇蛋白氨基酸的組成與含量見表4。雙孢蘑菇以及雙孢蘑菇蛋白氨基酸種類豐富,富含17種氨基酸,其中色氨酸未檢測出是因為其在堿性條件下溶解。從表4可以看出,雙孢蘑菇以及雙孢蘑菇蛋白中谷氨酸含量均為最高,其次為天冬氨酸。這兩種氨基酸屬于主要的鮮味氨基酸,是食物中重要的鮮味物質,提供給雙孢蘑菇獨特的香味。

表4 雙孢菇以及雙孢菇蛋白質中氨基酸組成以及含量(mg/g)

在17種氨基酸中,雙孢蘑蘑菇與雙孢蘑菇蛋白中半胱氨酸、組氨酸含量較低,其中半半胱氨酸為第一限制性氨基酸,組氨酸為第二限制性氨基酸。

由表5可以看出,其必需氨基酸含量較高,占總氨基酸含量的45.20%,必需氨基酸和非必需氨基酸的比例為0.776,高于世界衛生組織規定值0.666,說明雙孢蘑菇蛋白中氨基酸分布合理。雙孢蘑菇蛋白必需氨基酸含量與FAO/WHO模式、雞蛋蛋白氨基酸模式和FBN/IOM模式(美國食品營養研究會(Food and Nutrition Board,FNB)和美國全國科學院醫學研究所(Institute of Medicine,IOM)根據1～3歲兒童必需氨基酸需要量提出的氨基酸評分模式)進行比較,由表5可以看出,整體而言,雙孢蘑菇蛋白中必需氨基酸含量能夠完全滿足FBN/IOM模式,即能夠滿足1～3歲兒童所必需的氨基酸需要量。與FAO/WHO模式相比較而言,雙孢蘑菇蛋白中蛋氨酸+半胱氨酸含量相對較低,除此之外,均能夠滿足FAO/WHO模式所要求的必需氨基酸含量。雞蛋蛋白氨基酸模式中氨基酸含量要求較高,對于雙孢蘑菇蛋白而言,其含量整體而言相對較低,可能需要進一步的補充才能夠達到FAO/WHO模式的要求。

表5 雙孢蘑菇蛋白必需氨基酸質量分數與FAO/WHO模式、雞蛋蛋白氨基酸模式和FBN/IOM模式比較(mg/g protein)

2.4 雙孢蘑菇蛋白功能性質研究

2.4.1 不同pH下雙孢蘑菇蛋白的溶解度 蛋白的溶解性直接影響其功能性質及在食品中的應用。如圖6所示,雙孢蘑菇蛋白的溶解度曲線符合蛋白質的U型溶解規律,其在酸性條件下溶解度均低于35%,當pH達到等電點4時,溶解度最低為17.18%,這與前人在香菇柄中水溶性蛋白的等電點4.3及杏鮑菇分離蛋白的溶解度曲線相近,隨著pH逐漸增加到11,蛋白的溶解度逐漸升高但是仍低于45.26%,推測可能是因為雙孢蘑菇蛋白中含有較多的疏水性氨基酸與二硫鍵,從而使得其溶解度較低[26-27]。

圖6 不同pH下雙孢蘑菇蛋白的溶解度曲線

2.4.2 雙孢蘑菇蛋白功能性質 大豆蛋白是一種天然的優質植物蛋白,具有良好的營養價值以及多種功能特性,在食品領域中具有廣泛的應用[28]。因此通過雙孢蘑菇蛋白與大豆蛋白功能性比較初步判斷雙孢蘑菇蛋白的功能性質優劣。從表6可以看出,雙孢蘑菇蛋白的持水性和持油性都較大豆分離蛋白高。持水性較大的原因可能是雙孢蘑菇蛋白的極性氨基酸殘基較多,與水分子的作用較強[27]。當蛋白的持水性在1.49～4.71 mL/g時,較適合用于如湯、肉汁等粘性食品及焙烤食品。由此可見,雙孢蘑菇蛋白可作為粘性食品中的重要成分。

表6 雙孢蘑菇蛋白功能性質(%)

持油性是蛋白的非極性側鏈對油脂的結合,用來衡量蛋白的吸油能力,對于肉制品、奶制品以及餅干夾心等食品配方以及加工中,蛋白的持油性有著非常重要的作用[29]。雙孢蘑菇蛋白的持油性高于大豆蛋白,這可能與雙孢蘑菇蛋白的表觀結構有關。

而雙孢蘑菇蛋白的乳化性、乳化穩定性較低,這可能與雙孢蘑菇蛋白的溶解性有關,蛋白在它的表面起作用之前必須先溶解和移動到界面。雙孢蘑菇蛋白的起泡性略低于大豆分離蛋白,這也與雙孢蘑菇蛋白的溶解性低于大豆分離蛋白有一定的關系,因為高溶解度的蛋白是作為起泡性和起泡穩定性的先決條件。

綜合來看,雙孢蘑菇蛋白的持水性和持油性較高,在食品加工中,可做為粘性食品、肉制品、奶制品以及餅干夾心中的主要成分。

3 結論

由響應面優化試驗可知,雙孢蘑菇最佳提取條件為料液比為1∶3 (g/mL),提取液pH為9.9,提取時間2.6 h,提取溫度為57 ℃,得到蛋白提取率60.29%±0.19%,純度為72.70%±0.38%。其氨基酸含量豐富,必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量的比值為0.776,高于世界衛生組織規定值0.666,證明雙孢蘑菇蛋白中氨基酸分布合理。雙孢菇蛋白溶解度在pH為4時最低，為17.18%，pH為7.0時，其持水性為705.00%±5.06%,起泡性為80.04%±0.54%,氣泡穩定性為55.41%±0.09%,持油性為518.00%±2.06%,乳化性為17.81%±0.02%,乳化穩定性為10.11%±0.02%,其持水性和持油性高于大豆分離蛋白,可作為肉制品、奶制品以及餅干夾心等食品配方以及加工中重要成分。