余甘子總多酚的提取及其抗氧化活性研究

楊冰鑫,劉曉麗

(廣東工業大學輕工化工學院,廣東廣州 510006)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)屬大戟葉下珠屬,源于緬甸和印度,現在中南半島、印度尼西亞、菲律賓、中國等地均有分布,其中在中國的產量相對較多[1]。余甘子已被列為我國藥食同源品種之一,其果實含有多酚[2]、超氧化物歧化酶(SOD)、多糖、萜類化合物、脂肪酸、蛋白質、生物堿,以及12種維生素、17種氨基酸、16種微量元素等成分。余甘子藥理作用也極其廣泛,主要有抗氧化、保肝作用[3-5]、降低血脂作用、抗腫瘤等功效[6]。

近年來,大量文獻報道,很多植物中提取的酚類物質具有很好的抗氧化活性。植物酚類物質被應用于多種食品的抗氧化,如肉與肉制品、奶制品、焙烤食品等。據報道,余甘子多酚可以作為抗氧化劑替代品運用于食品的抗氧化;將余甘子多酚作為一種天然油脂抗氧化劑應用于餅干的加工;添加余甘子多酚的產品在貯存過程中的過氧化物值和酸價都明顯低于添加人工合成抗氧化劑BHA的產品等[7]。

本研究主要以溶劑浸提的方法提取余甘子多酚,以期得到余甘子多酚提取的最優方案,并對余甘子多酚的抗氧化活性進行研究,為余甘子在天然抗氧化劑的開發方面提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子鮮果 購自四川;昆明小鼠 健康狀況良好,14只,雌雄各半,8～9周齡,25～30 g,許可證號:SCXK(粵)2013-0034,廣州中醫藥大學;無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸(TCA)、無水碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、30%雙氧水、水楊酸 分析純,天津市致遠化學試劑有限公司;沒食子酸標準品(批號:149-91-7) HPLC≥98%,上海源葉生物科技有限公司;2-硫帶巴比妥酸(TBA)、福林酚溶液 分析純,上海麥克林生化科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 分析純,上海源葉生物科技有限公司;茶多酚 分析純,合肥巴斯夫生物科技有限公司;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、硫酸亞鐵 分析純,天津市大茂化學試劑;實驗用水 去離子水。

202-00A烘箱 上海索普儀器有限公司;800T搖擺式高速粉碎機 廣州市打樣電子機器設備有限公司;U-1950紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;SHA-BA恒溫振蕩器 常州奧華儀器有限公司;SHZ-(Ⅲ)真空抽濾機 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 沒食子酸標準曲線的繪制 精確稱量沒食子酸標準品0.0050 g,加入濃度為60%的乙醇溶液定容至50 mL,制成沒食子酸標準溶液,分別吸取不同濃度的沒食子酸標準品0.5 mL溶液于10 mL的容量瓶中[8],加入5 mL濃度為10%的福林酚溶液,搖勻后靜置5 min,最后加入4.5 mL的7.5%的碳酸鈉溶液定容至刻度線,靜置反應1 h,用紫外-可見光分光光度計在740 nm[9]處測量各個樣品的吸光值,以沒食子酸的濃度(mg/mL)為橫坐標,以吸光值為縱坐標制出沒食子酸的標準曲線[10]。

1.2.2 余甘子多酚的提取 新鮮余甘子去除果核,55 ℃烘26 h,用搖擺式高速粉碎機進行粉碎,過60目篩網既得余甘子粉末[11]。精確稱量1 g余甘子粉末,量取25 mL濃度為60%的乙醇溶液于三角瓶中,在溫度為50 ℃的恒溫振蕩器中回旋振蕩135 min,真空抽濾取上清液,濾渣重復上述操作,合并兩次濾液[12],即得到余甘子多酚提取液。

1.2.3 余甘子多酚含量的測定 采用福林酚比色法[13],以沒食子酸為標準品繪制曲線(見圖1)。取0.1 mL濃度為2 mg/mL余甘子提取液于10 mL的定量瓶中,按照1.2.1的方法測定吸光值,根據標準曲線計算總多酚含量,總多酚含量用mg GAE(沒食子酸)/mg果粉表示,計算公式如下:

圖1 沒食子酸標準曲線

總多酚含量(mg GAE/mg)=AV/m

式中,A-沒食子酸濃度(mg/mL);V-定容后體積(mL);m-樣品質量(mg)[14]。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 浸提時間對多酚提取效果的影響 余甘子粉末溶于濃度為60%的乙醇,溫度設置為50 ℃,提取時間分別為45、90、135、180、225 min,冷卻并進行真空抽濾,剩余的濾渣重復上述操作,合并兩次濾液,得到余甘子多酚提取液,測定其多酚含量。

1.2.4.2 浸提溫度對多酚提取效果的影響 余甘子粉末溶于濃度為60%的乙醇,溫度分別設置為30、40、50、60、70 ℃,135 min后冷卻并進行真空抽濾,剩余的濾渣重復上述操作,合并兩次濾液,得到余甘子多酚提取液,測定其多酚含量。

1.2.4.3 乙醇濃度對多酚提取效果的影響 余甘子粉末分別溶于濃度依次為15%、30%、45%、60%、75%的乙醇,溫度設置為60 ℃,135 min后冷卻并進行真空抽濾,剩余的濾渣重復上述操作,合并兩次濾液,得到余甘子多酚提取液,測定其多酚含量。

1.2.5 正交試驗 本研究采用了三因素三水平的正交試驗,考查浸提時間、浸提溫度、乙醇濃度三個因素對余甘子多酚提取效果的影響,篩選出最適的提取條件。正交試驗因素水平表如下:

表1 正交試驗因素水平表

1.2.6 抗氧化性研究

1.2.6.1 總還原能力的測定 采用鐵氰化鉀還原法[15]測定。取2.5 mL的pH6.6磷酸緩沖溶液,加入1 mL濃度依次為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品和2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液,振蕩混勻,在50 ℃的水浴鍋中放置20 min,取出冷卻至室溫,再加入2.5 mL的10% TCA溶液終止反應,4000 r/min離心10 min,取2.5 mL的上清液于試管中,加入2.5 mL的去離子水和0.5 mL的0.1% FeCl3溶液振蕩混勻后靜止10 min,在波長為700 nm處檢測其吸光度A值,平行3次實驗。

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的測定 采用DPPH清除自由基的方法[16],取3 mL的0.1 mg/mL DPPH-無水乙醇溶液,加入3 mL濃度依次為6、20、34、48、62 μg/mL的樣品,靜置30 min,4000 r/min離心10 min,最后在517 nm處測其吸光值為A1,以3 mL的樣品和3 mL的無水乙醇在517 nm處測的吸光值為A2,以3 mL的無水乙醇和3 mL的DPPH-無水乙醇在517 nm處測得的吸光值為A3,DPPH自由基清除率的計算公式為:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)]×100/A3

式中:A1為樣品上清液的吸光度;A2為樣品加無水乙醇的吸光度;A3為無水乙醇加DPPH上清液的吸光度。

1.2.6.3 羥自由基清除率的測定 采用水楊酸滴定法[17],利用H2O2與Fe2+反應產生·OH,加入水楊酸可以與·OH反應并產生有色物質,該物質在510 nm處有吸收峰。先向試管中加入9 mmoL/L FeSO4和1 mL的9 mmoL/L的水楊酸溶液各1 mL,濃度依次為0.4、0.8、1.2、1.6、2 mg/mL的樣品2 mL,最后加入1 mL的8.8 mmoL/L H2O2進行顯色反應,在37 ℃的水浴鍋中反應30 min,最后在510 nm處測其吸光值為A1,以不加樣品,用45%乙醇溶液代替樣品在510 nm處測得的吸光值為A3;以用去離子水代替8.8 mmoL/L的H2O2在510 nm處測得的吸光值為A2,羥自由基(·OH)清除率的測定公式如下:

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)]×100/A3

式中:A1為樣品上清液的吸光度;A2為不加H2O2時的吸光度;A3為空白上清液的吸光度。

1.2.6.4 自發性肝脂質氧化的抑制實驗 昆明小鼠,處理前禁食禁水12 h,脫臼處死,取其肝臟,用組織搗碎機搗碎,將搗碎后的肝組織和濃度為0.9%的冰生理鹽水混合,4000 r/min離心4 min,將沉淀進行再次研磨,然后混勻制成5%(m/v)的肝勻漿。采用硫帶巴比妥酸顯色法[18-19]進行檢測,取5%肝勻漿1 mL,濃度依次為10、40、70、100、130 μg/mL的樣品0.32 mL,在37 ℃的水浴鍋中水浴1.5 h,回旋的轉速為180 r/min,加入1 mL的EDTA和TCA的混合液(EDTA的濃度為0.1%,TCA的濃度為10%),4000 r/min離心10 min,再加入1 mL的0.67%TBA,沸水浴30 min,在532 nm處測吸光值A2,以加去離子水為空白對照,測得吸光值為A1,肝脂質氧化抑制率的計算公式為:

自發性肝脂質氧化抑制率(%)=[1-(A1-A2)]×100/A2

式中:A1為樣品上清液的吸光度;A2為空白上清液的吸光度。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

結果顯示沒食子酸的濃度在1～5 mg/mL范圍內,線性回歸方程為:y=0.1431x+0.0791,其中r=0.9997,線性關系良好。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 浸提時間對多酚提取效果的影響 從圖2可以看出,當浸提時間在45～135 min范圍內,隨著時間的增加,所提取的多酚含量逐漸增加,當浸提時間超過135 min時,隨著時間的增加,所提取的多酚含量先急劇減少然后無明顯變化,可能與余甘子多酚的穩定性差有關,當浸提時間過長時,其發生氧化變形的可能性增加,多酚含量出現下降。由圖2可知,最適的浸提時間為135 min,此時多酚的含量為(0.1920±0.002) mg GAE/mg。

圖2 不同浸提時間下多酚的提取效果

2.2.2 浸提溫度對多酚提取效果的影響 從圖3可以看出,當浸提溫度為30～50 ℃時,各提取液中多酚含量無明顯差異,當溫度在60 ℃時浸提液中總多酚含量達到最高值,此時多酚的含量為(0.2036±0.002) mg GAE/mg。當浸提溫度超過60 ℃時,高溫會導致余甘子多酚部分降解變性,使得余甘子多酚含量降低。因此,浸提的最佳溫度是60 ℃。

圖3 不同浸提溫度下多酚的提取效果

2.2.3 乙醇濃度對多酚提取效果的影響 從圖4可以看出,當乙醇的濃度范圍在15%～45%時,余甘子多酚隨乙醇濃度增加而逐級遞增,當乙醇的濃度為45%時,此時的所提取出的多酚含量最多為(0.2328±0.003) mg GAE/mg,當乙醇的濃度范圍在45%～75%時,所提取的多酚含量呈明顯下降趨勢,這與多酚的性質有關,多酚在乙醇中的溶解度相對于水較好,但當乙醇濃度較高時,會使細胞蛋白質凝固,影響其有效成分的釋放[20]。因此,浸提溶劑最佳濃度為45%。

圖4 不同乙醇濃度下提取多酚的提取效果

2.3 正交試驗設計結果

浸提時間、浸提溫度以及乙醇濃度對余甘子多酚的提取工藝存在一定的影響。從表2可以看出最優的組合是A2B3C2,此時浸提時間為135 min,浸提溫度為70 ℃,乙醇的濃度為45%，所提取的多酚含量為(0.2427±0.008) mg GAE/mg。通過方差分析可知,浸提時間、浸提溫度、不同乙醇濃度對余甘子多酚提取的影響極顯著;這三個因素對余甘子多酚提取含量的影響大小依次為:浸提溫度>乙醇濃度>浸提時間。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析

2.4 抗氧化性研究

2.4.1 總還原能力的測定 總還原能力可以解釋物質抗氧化活性的原理,作為抗氧化能力評價的指標之一[21],余甘子多酚類物質中的酚羥基將K3[Fe(CN)6]中的Fe3+還原成Fe2+,亞鐵氰化鉀和三氯化鐵在酸性條件下生成亞鐵氰化鐵,在700 nm處有吸收峰。從圖5可以看出,在樣品濃度為0.2～1 mg/mL范圍內,余甘子多酚和茶多酚的總還原能力隨濃度的增加而增加,余甘子多酚的總還原能力低于茶多酚。

圖5 各個樣品總還原能力的測定

2.4.2 DPPH自由基清除率的測定 余甘子多酚類物質中的酚羥基提供電子可與DPPH自由基中的孤對電子有效的結合,從而清除DPPH自由基。從圖6可以看出,在樣品濃度為6～62 μg/mL范圍內,余甘子多酚對DPPH自由基的清除能力明顯優于茶多酚,余甘子多酚和茶多酚對DPPH自由基清除的EC50值分別為為(9±0.01)和(27.1±0.05) μg/mL。因此,余甘子多酚成分對DPPH自由基的清除能力比茶多酚強。

圖6 DPPH自由基的清除能力

2.4.3 羥自由基清除率的測定 余甘子多酚類物質中的酚羥基作為供電子基團與具有極強吸電子能力的羥自由基結合,從而清除羥自由基。從圖7可以看出,在樣品濃度為0.4～1.1 mg/mL范圍內,余甘子多酚對羥自由基的清除能力優于茶多酚,當樣品濃度升高,在濃度為1.1～2 mg/mL范圍內,余甘子多酚對羥自由基的清除能力稍低于茶多酚。進一步考察余甘子多酚和茶多酚對羥自由基清除的EC50值分別為(0.47±0.01)和(0.63±0.03) mg/mL。因此,余甘子多酚對羥自由基的清除能力優于茶多酚。

圖7 多酚對羥自由基的清除作用

2.4.4 對小鼠自發性肝脂質氧化的抑制作用 肝脂質氧化產生大量的丙二醛及其它醛類物質,丙二醛可與TBA生成有色化合物在532 nm處有吸收峰。從圖8中可以看出,在樣品濃度為40～130 μg/mL范圍內,余甘子多酚對自發性肝脂質過氧化的抑制作用明顯優于茶多酚,余甘子多酚對肝脂質過氧化抑制的EC50值為(122±2) μg/mL。因此,余甘子多酚成分對自發性肝脂質氧化的抑制能力比茶多酚強。

圖8 樣品對肝脂質氧化的抑制作用

3 結論

浸提時間、浸提溫度、乙醇濃度對余甘子多酚提取都有很大的影響。本實驗以浸提時間為135 min、浸提溫度為70 ℃、乙醇濃度為45%,所提取的余甘子多酚為(0.2427±0.008) mg GAE/mg,提取效果較好。通過對總還原能力、DPPH自由基和羥自由基清除率、自發性肝脂質過氧化抑制活性的測定,表明余甘子多酚的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、自發性肝脂質氧化抑制率均明顯高于茶多酚,可以作為抗氧化劑替代品用于食品的抗氧化,也可以進一步開發為功能性食品的添加物。