紅參紅景天混合物提取工藝及其抗疲勞作用

李 晶,朱 娜,鄭 飛,趙幻希,王 楠,孫紅梅,陸澤林,越 皓,*

(1.長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院,吉林長春 130117;2.青島市中心醫院藥學部,山東青島 266042)

人參(PanaxginsengC. A. Mey.)為五加科植物人參的干燥根和根莖,是一種名貴中藥。紅參為人參經蒸制等加工后的干燥根和根莖,紅參氣味濃厚、甘而兼溫、功偏溫補。用于脾腎虛空、真陽衰弱之患[1]?，F代藥理學研究表明,紅參中特有的皂苷類成分Rg3和非皂苷成分等都有很好的抗疲勞作用[2-5]。紅景天為景天科植物大花紅景天Rhodiolacrenulata(Hook. f. et Thoms.)H. Ohba的干燥根和根莖,具有扶正固本,補氣養血,清熱潤肺的功效,主治氣虛體弱、病后畏寒、氣短乏力等癥[6]。紅景天中的主要活性成分紅景天苷可通過調節抗氧化系統[7]、能量代謝系統[8]及中樞系統[9]三方面,從而發揮抗疲勞作用[10-13]。紅景天和紅參均可用于氣虛乏力之諸證,補氣補血補神的功效與中醫上所稱的“虛則補之”相契合,且紅景天性寒,紅參性溫,二藥合用,寒溫并用,使溫補之中不致偏燥之性,相得益彰。現代研究顯示,二藥具有類似的“適應原樣”作用[14]。因此課題組推測二藥配伍組方會具有更好的抗疲勞功效,然而目前,尚無將上述兩種藥物組方研究其抗疲勞功效的相關報道。

本研究根據我國中醫對疲勞病因、病機的分析和治法治則的理論以及中醫標本兼治的思想,并結合現代藥理學研究,將紅參和紅景天進行配伍組方,以期獲得具有抗疲勞作用的更有效組方。在前期工作中發現,將紅參和紅景天按比例混合后,進行乙醇回流提取,所得到的提取物具有較單獨提取后合并的提取物更好的抗疲勞活性。為進一步驗證其抗疲勞的作用,確定其最佳提取工藝,本研究采用正交試驗考察了提取因素對工藝的影響,從中優選出紅參紅景天混合提取物提取的最佳工藝，并對紅參和紅景天混合提取物(Red ginseng and Rhodiola crenulata,RR)進行抗疲勞功效觀察,以期為開發具有抗疲勞功能的保健食品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅參 購于吉林省撫松縣萬良人參市場;紅景天 由同仁堂提供;人參皂苷Re、紅景天苷對照品 上海源葉;香草醛 上海海曲化工有限公司;其余試劑 均為國產分析純;80只健康昆明小鼠 體重(20±2) g,雄性,合格證號SCXK2013-0005,購于吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心;小鼠血清尿素氮、乳酸及肝糖原檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱 美國Agilent公司;UV-9200型紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總皂苷的含量測定

1.2.1.1 標準曲線的制備 精密稱定人參皂苷 Re 對照品1.1 mg,甲醇溶解,制成每1 mL含1.1 mg對照品的溶液。精密吸取對照品溶液10、20、40、80、120、160、200 μL,分別置于具塞試管中,60 ℃恒溫水浴揮干,加入5%香草醛-冰醋酸0.2 mL,使殘渣溶解,再加入高氯酸0.8 mL,置60 ℃恒溫水浴上充分混勻后加熱15 min,取出后流水冷卻10 min,加入冰醋酸5 mL,搖勻,以同法制得的不加對照品溶液的試劑作空白,于540 nm波長測定吸光度值[15]。以吸光度(Y)為縱坐標,對照品濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線為Y=11.96X-0.007(R2=0.9999)。

1.2.1.2 供試品溶液的制備和皂苷含量測定 樣品制備:分別取紅參和紅景天(1∶1)研磨成粗粉,混合加入一定量的乙醇,在適當溫度下進行有效成分的回流提取,減壓濃縮回收乙醇,濃縮液在10 Pa,-50 ℃的條件下,冷凍干燥48 h,得到樣品粉末。精密稱取干燥粉末30 mg,甲醇超聲處理使溶解,得到3 mg/mL溶液,搖勻,濾過,取續濾液50 μL,即得供試品溶液。取續濾液置磨口帶塞試管中,根據回歸方程計算樣品皂苷含量。

式中:m為根據標準曲線計算的皂苷的質量(mg);V0為供試品溶液的體積(mL);N為供試品溶液稀釋倍數;V為供試品溶液總體積(mL);W為所取樣品的質量(g)。

1.2.2 紅景天苷的含量測定

1.2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm);柱溫30 ℃;以V(甲醇)∶V(水)=85∶15作為流動相;體積流量0. 4 mL/min;進樣量5 μL;檢測波長275 nm。

1.2.2.2 標準曲線的制備 精密稱定紅景天苷對照品約2.02 mg,置2 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL含1.01 mg對照品的溶液。精密吸取對照品溶液5、10、20、40、80、160、240、320、400、500 μL,分別置于1 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,以0.22 μm微孔濾膜濾過;以紅景天苷對照品的質量(X)對峰面積(Y)進行線性回歸,繪制標準曲線為Y=71442x-2.175(R2=0.999)。

1.2.2.3 供試品溶液的制備和紅景天苷含量測定 取1.2.1.2項下干燥粉末約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇10 mL,密塞,稱定質量,在超聲頻率40 Hz,超聲功率800 W,溫度60 ℃條件下,處理30 min,冷卻至室溫,再稱定質量,用甲醇補足減失的質量,搖勻,以0.22 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得[16]。根據回歸方程計算樣品紅景天苷的含量。

式中,x為根據標準曲線計算的紅景天苷的質量(mg);V0為供試品溶液的體積(mL);N為供試品溶液稀釋倍數;V為供試品溶液總體積(mL);W為所取樣品的質量(g)。

1.2.3 工藝條件及參數的優選

1.2.3.1 單因素實驗設計 按處方比例稱取紅參和紅景天各20 g,共取4或3份,分別加入料液比為1∶10 g/mL,濃度分別為60%、70%、80%、90%的乙醇溶液提取3次,每次90 min,考察乙醇體積分數對人參總皂苷和紅景天苷含量的影響;

分別加入料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 g/mL的80%的乙醇,提取3次,每次90 min,考察料液比對人參總皂苷和紅景天苷含量的影響;

分別加入料液比為1∶10 g/mL,濃度為80%的乙醇溶液提取3次,分別提取30、60、90、120 min,考察提取時間對人參總皂苷和紅景天苷含量的影響;

分別加入料液比為1∶10 g/mL,濃度為80%的乙醇溶液分別提取1、2、3次,每次90 min,考察提取次數對人參總皂苷和紅景天苷含量的影響[17-19]。

1.2.3.2 正交試驗優選提取工藝 以單因素實驗結果為基礎,采用乙醇回流提取法,選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(D)為考察因素,采用L9(34)的正交設計進行試驗,以人參總皂苷和紅景天苷的含量為考察指標進行綜合評價,其權重系數均為50%,綜合評分(X)=(人參總皂苷含量/人參總皂苷含量最大值)×100×50%+(紅景天苷含量/紅景天苷含量最大值)×100×50%,其中含量最大值指按9種提取工藝提取兩種藥材所得樣品中含人參總皂苷或紅景天苷的最大值,以綜合評分為評價指標,分別取9份處方比例的藥材,按因素水平表(表1)設計條件進行回流提取。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.4 抗疲勞功能評價

1.2.4.1 動物分組與給藥 實驗室溫度(23±2) ℃,12 h晝夜循環,自由飲食攝水,適應性喂養7 d。隨機分成空白對照組,RR高、中、低劑量組(3.75、1.25、0.625 g/kg),每組20只?？瞻讓φ战M小鼠給予同體積的生理鹽水,各組小鼠灌胃30 d。

1.2.4.2 負重游泳時間的測定 末次給藥30 min后,每組隨機選取10只小鼠,將小鼠尾根部負荷5%體重鉛皮,置于游泳箱內。水深不少于30 cm,水溫(25±1.0) ℃,記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間,即小鼠負重游泳時間[20-21]。

1.2.4.3 小鼠血清尿素氮、乳酸及肝糖原水平的測定 末次給藥30 min后,每組中隨機選取10只小鼠,在30 ℃水中不負重游泳90 min,休息60 min后眼球取血約0.5 mL,脫頸處死,迅速取肝臟,血液樣品離心后收集血清,參照試劑盒說明書進行血清尿素氮、血乳酸及肝糖原水平檢測[22-24]。

1.3 數據處理

采用SPSS 16.0 軟件對所有數據進行處理,數據用平均值±標準差(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,以p<0.05 作為顯著性差異,p<0.01 作為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

乙醇濃度對人參總皂苷和紅景天苷含量的影響見圖1A。隨著乙醇濃度的增加,人參總皂苷的含量逐漸增加,分別為20.01、65.73、67.98和69.21 mg/g,乙醇濃度在70%后,人參總皂苷含量增幅減緩,紅景天苷的含量在乙醇濃度為80%時達到最高,即0.01981 mg/g,比乙醇濃度為90%時略高。因此,選擇乙醇濃度為80%。

圖1 單因素實驗結果

料液比對人參總皂苷和紅景天苷含量的影響見圖1B。人參總皂苷和紅景天苷的含量均在料液比為1∶10 g/mL時最高,分別為67.98和0.01981 mg/g,故選擇料液比為1∶10 g/mL。

提取時間對人參總皂苷和紅景天苷含量的影響見圖1C。人參總皂苷和紅景天苷的含量均在提取時間為120 min時達到最高,分別為70.69和0.02136 mg/g,故選擇提取時間為120 min。

提取次數對人參總皂苷和紅景天苷含量的影響見圖1D。人參總皂苷(40.14、56.98、67.98 mg/g)和紅景天苷(0.001426、0.004196、0.02081 mg/g)的含量隨著提取次數的增加而不斷增加,綜合考慮提取時間和提取效率,沒有繼續增加提取次數,故選擇提取次數為3次。

2.2 正交試驗優選提取工藝

每個試驗條件平行3次,分別按“1.2.1”和“1.2.2”下方法計算人參總皂苷和紅景天苷含量,結果見表2和表3。由表2綜合評分直觀分析結果可知,4個因素對人參總皂苷和紅景天苷含量的影響順序為A

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

2.3 RR對小鼠游泳力竭時間的影響

由表4可知，連續給藥30 d后,各劑量組與空白對照組比較,高(p<0.001)、中(p<0.001)和低(p<0.01)劑量組小鼠的力竭游泳時間均顯著延長,結果表明,不同劑量RR均可延長小鼠負重游泳力竭時間,加強小鼠運動耐力。

2.4 RR對小鼠血清尿素氮、乳酸及肝糖原水平的影響

末次給藥30 min后,對各組小鼠血清尿素氮、血乳酸及肝糖原水平進行檢測(表4),結果顯示,與空白對照組比較,高(p<0.001)、中(p<0.05)和低(p<0.05)劑量組小鼠血清尿素氮水平均顯著降低。血尿素氮是蛋白質有氧代謝的產物,長時間劇烈運動后,機體不能通過分解糖和脂肪來提供足夠的能量時,蛋白質、氨基酸和核苷酸分解代謝就會加強,脫氨基產生氨,因此尿素氮含量上升,機體對運動負荷的適應能力下降[25-26]。研究顯示,RR能夠降低游泳后小鼠血清尿素氮的含量,調節機體尿素氮含量異常,從而增強機體耐力。

由表4可知,小鼠力竭游泳后,與空白對照組比較,高(p<0.001)和中(p<0.05)劑量組小鼠肝糖原水平均顯著升高。肝糖原是機體內重要能源物質儲備的形式,能夠提供運動所需的能量,可長時間維持運動的血糖水平,從而緩解疲勞[27],實驗表明,RR能有效減少運動引起的肝糖原的消耗,增加體內能源物質肝糖原的含量,從而延長糖代謝的時間,延長小鼠負重游泳力竭時間,延緩疲勞的產生。

表4 RR對小鼠負重游泳力竭時間、血清尿素氮、血乳酸及肝糖原水平的影響

RR能明顯降低小鼠血清中乳酸含量,其中高劑量組(p<0.001)和中劑量組(p<0.05)乳酸水平與空白對照組比較具有顯著性差異。當機體內氧供應相對不足時,糖原代謝增加,血清中乳酸等代謝產物增多,從而引起肌肉收縮效率下降導致體力衰竭[28-30]。因而機體內乳酸含量與疲勞程度呈正相關。測定結果表明,RR能夠減少運動后血清中乳酸水平,減輕機體代謝產物的堆積,改善機體能量代謝,有利于機體對抗運動性疲勞。

3 結論

RR最佳提取工藝參數為:乙醇濃度80%,料液比1∶10 g/mL,提取時間120 min,提取次數3次。在此最佳提取工藝條件下,測定了RR中人參總皂苷平均含量為(93.96±4.03) mg/g,紅景天苷平均含量為(0.01263±0.00015) mg/g。通過動物實驗對RR的抗疲勞活性進行了考察,結果表明RR能夠顯著延長小鼠力竭游泳時間、增加力竭運動過程中肝糖原的儲備、降低血清尿素氮和乳酸水平(p<0.001或p<0.05),通過調節機體的代謝狀態,從而提高小鼠的運動能力,起到抗疲勞作用。本研究為開發安全有效的抗疲勞保健食品提供了基礎理論支撐。