食品中肌醇的微生物檢測方法研究

范 迪,張 寧,楊 燕,聞宏亮,秦 峰,劉 浩,范一靈

(上海市食品藥品檢驗所,上海 201203)

肌醇廣泛分布在動植物體內,是動物、微生物的生長因子。肌醇作為一種“生物活素”參與體內的新陳代謝活動。在醫藥領域中,肌醇可以作為藥物治療肝硬化、脂肪肝、糖尿病等疾病[1]。肌醇有9種同分異構體[2],其中具有光學異構體的D-手性肌醇[3]最值得關注,其廣泛分布在蕎麥、苦瓜等食物中,量少但具有類胰島素作用[4],是當下研究的新領域。高等動物若缺乏肌醇,將會出現生長停滯和毛發脫落等現象,因此食用富含肌醇的食品對人體健康也是尤為重要。在食品領域中,肌醇存在于許多天然食品中,也常作為營養劑定量加入功能飲料、功能性乳粉等強化食品中。由于肌醇強化食品的食用人群通常包括嬰幼兒及免疫力低下等特殊人群,肌醇的添加量與安全性息息相關,對其準確定量尤為重要。

目前國內外研究肌醇測定方法的文獻主要集中于高效液相色譜法[5-6]、液相色譜-質譜法[7-8]、氣相色譜法[9-10]、氣相色譜-質譜法[11-12]和離子色譜法[13]等,而微生物法[14-17]是目前國標方法GB 5009.270-2016《食品安全國家標準食品中肌醇的測定》[18]中測定食品中肌醇的仲裁法,但其檢測方法存在嚴重缺陷,選用的菌種釀酒酵母菌ATCC 9080無肌醇特異性,結果的重現性較差,無法準確定量測定。

因此,本研究在通常用于維生素含量測定的菌種中選取葡萄汁酵母菌及釀酒酵母菌各三株,重新篩選出肌醇特異性菌種,并比較市售干粉培養基及自配肌醇測定用培養基,對培養條件進行優化,以期建立測定食品中肌醇含量的微生物方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肌醇測定培養基 青島日水生物科技有限公司、上海瑞楚生物科技有限公司、按配方成分實驗室自配[18];麥芽浸粉液體培養基 上海瑞楚生物科技有限公司;肌醇標準品 SIGMA,LRAA9145,99.5%;葡萄汁酵母菌CICC1465、CICC31161、ACCC20202、釀酒酵母菌 CICC32249、CICC32919、ATCC9080、ACCC20065 中國工業微生物菌種保藏管理中心。乳粉 雅培益力佳SR營養配方粉;豬肉 愛森后腿精肉;薏米 上海忠緣弘食品有限公司;南瓜 上海歐尚超市有限公司;獼猴桃 新西蘭佳沛綠奇異果,佳沃(青島)果業有限公司;功能性飲料 紅牛維他命飲料有限公司。

UV2450分光光度計 日本島津公司;PYX-DHS-600-BS型恒溫培養箱 上海賀德實驗設備有限公司;SI-600R型振蕩培養箱 Jeiotech公司;HV-110型壓力蒸汽消毒器 Hirayama公司;酶標儀 美國BioTek公司;打碎機 耐歐;勻漿機 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 活化培養 將菌種凍存管接種到麥芽浸粉液體培養基中，于(30±1) ℃培養2～3 d增菌活化(晃動培養容器,至肉眼可見渾濁),再接種一環到麥芽浸粉瓊脂斜面培養基上,于(30±1) ℃培養2～3 d后,制成貯備菌種,貯于4 ℃冰箱中,保存期不超過2周。臨用前接種到新的麥芽浸粉瓊脂斜面培養基上。

使用的前一天將貯備菌種轉接到10 mL滅菌的麥芽浸粉液體培養基中,于(30±1) ℃培養20～24 h。取麥芽浸粉液體培養基培養物,在無菌條件下2000 r/min離心15 min,棄去上清液,加入10 mL已滅菌的生理鹽水重新分散細胞,于旋渦混合器上快速混合均勻,離心15 min,傾去上清液。重復離心和清洗步驟三次。最后一次細胞分散液用生理鹽水懸浮,制成混懸液,備用。用分光光度計,以氯化鈉溶液作空白,550 nm波長下測定該接種菌懸液的透光率,調整加入的菌液量或者加入一定量的氯化鈉溶液使該菌懸液透光率在60%～80%,盡快使用。

與現行食品安全國家標準中直接從麥芽浸粉瓊脂斜面上制備菌懸液相比,本試驗采用臨用前從貯備菌種轉接到麥芽汁肉湯,(30±1) ℃培養20～24 h的培養物來制備接種菌懸液,以此減少斜面洗菌過程中帶入瓊脂對后續處理過程中菌液濃度的透光率或吸光度測量造成的誤差,提高實驗準確度。

1.2.2 菌種篩選 使用酶標儀結合96孔板進行菌種在無肌醇添加的培養基(S2)以及添加最高濃度肌醇的培養體系(S10)中培養0～48 h,分析比較菌種生長的吸光度值隨時間的變化情況。

1.2.3 培養基比較 通過酶標儀對市售肌醇測定用培養基以及實驗室自配肌醇測定用培養基進行比較,對選定菌株分別使用1.1中三種肌醇測定用培養基,測定標準曲線濃度點的培養體系,在培養終點以標準曲線各濃度點吸光度平均值對濃度作圖。

1.2.4 標準曲線

1.2.4.1 肌醇母液的配制 肌醇標準品置于五氧化二磷的干燥器中干燥24 h以上,精密稱定50 mg(精確至0.1 mg)至250 mL容量瓶中,用二級水(后文提及的水均為二級水)溶解配制成0.2 mg/mL的肌醇標準儲備液;吸取5 mL肌醇標準儲備液至100 mL棕色容量瓶中,制成10 μg/mL的肌醇標準中間液;吸取20 mL肌醇標準中間液至100 mL容量瓶中,用水定容制成2 μg/mL的工作液。儲備液與中間液于4 ℃冰箱保存,工作液需臨用前配制。

1.2.4.2 標準曲線管的制作 取標準系列管S1～S10,每根試管加入肌醇測定培養基(青島日水)5 mL,其中S3到S10分別加入2 μg/mL肌醇標準工作液0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5 mL,將S1～S10加水補足體積至10 mL。最終配制成S3～S10濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0 μg/mL的標準管,每個標準管一式三份。

1.2.4.3 滅菌及培養 每支試管內加入一粒玻璃珠(玻璃珠大小盡可能一致,防止菌種沉淀蓄積影響最終測定),蓋上試管帽,121 ℃滅菌5 min。將上述試管冷卻至30 ℃以下,除接種空白試管S1外,向其余各試管中滴加約150 μL CICC 1465菌懸液,加帽,渦旋混勻。將試管固定在振蕩培養箱內,用約140～160 r/min振蕩速度,在(30±1) ℃黑暗振蕩培養約40～48 h。

1.2.4.4 標準曲線測定 經過培養后,未接種菌懸液的試管S1應是澄清的,否則結果無效。最高濃度標準管相隔2 h測定的吸光度差值小于2%即為培養終點。取出所有培養管,用S1作空白,讀出S2的讀數。再以S2作空白,調節吸光度為0,依次讀出其他每支試管的吸光度。以肌醇標準系列的濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標采用Logistic四參數擬合標準曲線計算試樣中肌醇含量。超出標準曲線管范圍的結果需舍去,每只試管測得的濃度不超過該編號試管濃度均值的±15%,超過亦舍去,符合要求的試管數不少于所有四個編號待測液總管數的2/3,否則需重新實驗。

1.2.5 方法的應用

1.2.5.1 樣品前處理 乳粉、薏米等需用研缽研磨、過篩(篩板孔徑0.3～0.5 mm);豬肉用打碎機制成肉糜;南瓜、獼猴桃等試樣需勻漿混勻;功能性飲料用前振搖混合。取含肌醇0.5～2.0 mg的試樣,乳粉、豬肉約1～2 g,薏米、南瓜、獼猴桃及功能性飲料約5～10 g置于250 mL錐形瓶中,加入80～100 mL 0.44 mol/L的鹽酸溶液混勻,以鋁箔紙封口,在滅菌釜中125 ℃水解1 h。取出,冷卻至室溫,加入2 mL氫氧化鈉溶液(600 g/L),冷卻至室溫,用10、1 mol/L的氫氧化鈉溶液或1、0.1 mol/L的鹽酸溶液調節pH至5.2,轉入250 mL容量瓶中,定容至刻度。搖勻,過濾,收集濾液作為試樣提取液。調整稀釋度,使待測液肌醇的濃度在0.1～1.0 μg/mL范圍內。

向待測液試管中加入水、試樣提取液和肌醇測定培養基,從試管1到試管4分別加入試樣提取液1、2、3、4 mL,培養基各5 mL,每根試管均加水補足體積至10 mL,每個濃度試管一式三份。滅菌及培養過程同標準曲線。

1.2.5.2 肌醇的計算 試樣中肌醇含量計算公式:

式中:M為試樣中肌醇的含量,mg/100 g;m為樣品質量,g;Cx為根據標準曲線計算得的肌醇濃度(X)折算每支試管中加入的待測液體積獲得肌醇含量所得的平均值,μg;f為樣液稀釋倍數。

1.3 數據處理

根據上述計算公式測得試樣中的肌醇含量,標準曲線擬合采用ELISA軟件的Logistic四參數方程并進行分析,數據結果偏差以RSD%表示。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選結果

菌種篩選結果見圖1,其中每一小格分別為相應菌種生長的吸光度值隨時間(t/h)的變化情況。結果表明除CICC 32249和CICC 1465兩株酵母菌,其余菌種的肌醇特異性均較差。因此,初步篩得CICC 32249和CICC 1465兩株酵母菌,其生長對肌醇需求具有特異性。

圖1 肌醇特異性菌株生長比較

由圖1可知,CICC 1465在48 h內已經能夠達到生長平臺,而CICC 32249吸光度值仍在增長,還未達到生長平臺。進一步比較釀酒酵母CICC 32249和葡萄汁酵母CICC 1465對于本方法的適用性。以肌醇對照品作為質控樣品,分別以兩株菌進行測定,見表1,CICC 32249實驗測得的結果與理論值偏差達到25%以上,而CICC 1465實驗測得的結果與理論值偏差小于8%,證明CICC 1465在微生物法中測定肌醇更準確,且生長時間較CICC 32249更短,因此最終選擇葡萄汁酵母CICC 1465作為試驗菌種。

表1 CICC 32249和CICC 1465的肌醇測定比較

2.2 培養基比較結果

如圖2,結果表明以上三種培養基并無明顯差異,因此本實驗后續均選用市售青島日水肌醇測定用培養基。

圖2 肌醇測定用培養基的比較

2.3 標準曲線結果

本方法根據菌液吸光度與肌醇濃度的曲線關系,以肌醇標準系列的濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,運用ELISA軟件采用Logistic四參數進行擬合，使曲線方程與標準管每一個濃度點更加契合,擬合效果優于線性等其他擬合方式,結果更準確,見圖3。肌醇含量回歸方程為:Y=(1.21585-0.0208)/[1+(X/0.3364)-2.96406]+0.0208,R2>0.996。其中,X為肌醇濃度,μg/mL;Y為吸光度值。曲線范圍為:0.1～1.0 μg/mL。

圖3 肌醇的標準曲線

2.4 方法學實驗結果

2.4.1 精密度實驗 將富含肌醇的功能性飲料、強化乳粉和天然食品豬肉、南瓜、獼猴桃、薏米各取平行樣兩份,分別配制成四個濃度梯度,每個濃度三份平行,按照1.2.5.1項下處理,測定肌醇含量,進行精密度實驗,結果見表2。

表2 各基質中肌醇的精密度實驗結果

強化肌醇的乳粉、功能飲料和天然食品中肌醇的含量,同一樣品兩份平行間相對偏差均小于2%,結果表明該方法的精密度良好,實驗結果可靠。

2.4.2 重復性實驗 稱取適量樣品,分別配制6份供試品,進行重復性實驗,結果見表3,結果均在6%以內,表明該方法的重復性良好,實驗結果可靠。

表3 重復性實驗結果(n=6)

2.4.3 回收率實驗及檢出限 對六種基質的樣品分別以1∶1進行加標回收,重復測定6次,計算平均回收率,見表4,結果均在94%～107%之間,RSD小于10%,回收率評價較好。

表4 加標回收率實驗結果

通過對空白管重復測定20次得到方法的檢出限為0.015 μg/mL,以取樣1 g,定容至250 mL計,方法檢出限為0.375 mg/100 g。

3 結論

本研究在原有國標方法的基礎上,篩選出對肌醇特異性更強的菌種葡萄汁酵母菌(CICC 1465),相比此方法長久以來選用的葡萄汁酵母菌(ATCC 9080)具有創新性。通過優化后續試驗條件對強化食品及天然食品進行肌醇含量檢測,精密度相對偏差小于2%,重復性小于6%,回收率在96%～107%之間,方法學評價良好,結果準確可靠。方法檢出限為0.375 mg/100 g,遠低于現行國標檢出限12.5 mg/100 g。可用于檢測肌醇含量較低的食品,與其他檢測方法復雜的前處理過程相比,微生物法具有操作簡單,成本較低,靈敏度高等優點。本研究可以為食品安全國家標準的方法修訂工作提供參考和支持。