不同品種甜櫻桃中不同形態酚酸的比較及其抗氧化性分析

高 媛,馮曉元,姜 楠,王 蒙,平 華,左驥民,馬智宏,*

(1.北京農業質量標準與檢測技術研究中心,農業部農產品質量安全風險評估實驗室(北京),北京 100097;2.北京市大興區農業技術推廣站,北京 102607)

櫻桃營養豐富,因富含多種有效成分而具有一定的保健價值,其中尤以酚類物質最為突出[1]。酚類物質具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抑菌等生物活性。酚酸是酚類物質中的一類,約占植物源食品中酚類化合物的三分之一,多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物。研究表明,酚酸還與果蔬采后運輸、果實色澤、風味等密切相關[2-3]。酚酸類物質的種類和含量因品種、產地、發育階段、提取方式等不同而有所差異[4-5]。

果蔬中的酚酸類物質根據存在形式可以分為游離型、游離酯型和結合型。游離酯型和結合型酚酸可在酸、堿或酶的作用下水解釋放出來,從而被檢測到。且有研究表明,對于植物中存在的絕大多數游離酯型,在堿性條件下更容易水解,酸性條件則不利于酚酸的釋放[6]。不同形態的酚酸已在多種水果中得到分離和鑒定[7-8]。盡管關于櫻桃中酚酸的組成和含量已有很多報道,但大多數研究僅關注了可溶性的游離型酚酸,而對游離酯型和結合型關注較少。研究表明,游離酯型酚酸在體內外試驗中均具有較強的抗氧化活性[5,9]。因此,全面分析櫻桃中酚酸類物質的含量和組成能更好的分析其營養價值。

本研究利用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)對5個櫻桃品種,包括彩虹、艷陽、薩米脫、23-51和瓦列里中的游離型、游離酯型和結合型酚酸含量進行測定和差異性評估,并對其抗氧化特性進行了分析,以期為櫻桃中功能成分開發提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5個甜櫻桃品種彩虹、艷陽、薩米脫、23-51和瓦列里 均采自北京市林業果樹科學研究院試驗園(北京通州,39°41′N,116°41′E)。采樣時,挑選大小一致,無損傷,無病蟲害的果實,用保溫袋包裹,放進泡沫保溫箱中,在2 h內運回實驗室。每個品種采集三個重復,每個重復約2 kg。

Acquity TM超高效液相色譜儀-TQS串聯質譜儀、電噴霧電離(electron spray ionization,ESI)接口 美國Waters公司;IKA A11分析研磨機、KS260搖床 德國IKA公司;BUCHI-R-210旋轉蒸發儀 瑞士BUCHI;Milli-Q超純水機 美國Mimpore公司;3-30k臺式高速離心機 德國Sigma公司;PAL-2手持糖度計 日本ATAGO;pHS-3C精密pH計 上海雷磁。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 采集的櫻桃樣品中部分用來測定單果重、可溶性固形物含量(Brix)、pH和可滴定酸;剩余樣品用于酚酸類物質的提取和測定,在液氮保護下研磨成粉末,于-80 ℃保存待用。

1.2.2 不同品種櫻桃理化指標的測定 取櫻桃果實30顆稱重,計算單果重。30顆果實擠壓取上清獲得櫻桃汁,可溶性固形物含量(SSC)使用手持糖度計測量。pH采用電子pH計測定。可滴定酸(TA)使用酸堿滴定法測定,吸取2 mL上清液,加蒸餾水50 mL,并滴加酚酞指示劑2滴,用0.1 mol/L NaOH滴定至微紅色，且30 s不褪色,測定結果以乳酸計。

1.2.3 酚酸類物質的提取

1.2.3.1 游離型酚酸 酚酸提取參照本實驗室前期優化的方法做了適當改動[10]。取10 g樣品于50 mL離心管中,加入20 mL 80%甲醇水提取液(v/v,含0.1%鹽酸),渦旋振蕩10 s,室溫下超聲提取20 min,超聲功率700 W,于4 ℃ 10000 r/min離心5 min,將上清液轉移至50 mL容量瓶。重復上述步驟一次,合并上清液,定容至50 mL。混勻后過0.22 μm有機相濾膜,待測。

1.2.3.2 游離酯型酚酸 游離酯型酚酸提取方法參考Li等[11]的方法并做了適當修改。取10 g樣品于50 mL離心管中,加入20 mL 80%甲醇水提取液(v/v,含0.1%鹽酸),渦旋混勻,室溫下超聲提取20 min,超聲功率700 W,于4 ℃ 10000 r/min離心5 min,將上清液轉移至100 mL雞心瓶。重復上述步驟一次,合并上清液,剩余殘渣可用于結合型酚酸的測定,上清液于旋轉蒸發儀上在40 ℃下減壓蒸發至15 mL以內。轉移至100 mL離心管中,加入20 mL 4 mol/L NaOH,充入N2,40 ℃氣浴振蕩避光水解2 h。之后用濃HCl調節pH至2。20 mL乙酸乙酯萃取兩次,合并萃取液,在旋轉蒸發儀上40 ℃下減壓蒸發至近干,用10 mL 50%甲醇水(v/v)溶解,混勻過0.22 μm有機相濾膜,備用。該提取方法中,游離型和游離酯型酚酸均被乙酸乙酯萃取,因此最終游離酯型酚酸含量為該部分得到的酚酸含量減去上一節(1.2.3.1)中對應游離型酚酸的數據。

1.2.3.3 結合型酚酸 取上一步離心后剩余的殘渣,加入20 mL 4 mol/L NaOH,充入N2,40 ℃氣浴振蕩,避光水解2 h,濃HCl調節pH至2。用20 mL乙酸乙酯萃取兩次,合并萃取液,40 ℃下減壓蒸發至近干,用10 mL 50%甲醇水(v/v)溶解,混勻過0.22 μm有機相濾膜,備用。

1.2.4 分離和檢測 色譜條件:色譜柱為Acquity HSS C18 column(2.1×150 mm;1.8 μm);柱溫45 ℃;樣品室溫度10 ℃,進樣體積5 μL;流動相A為0.1%甲酸水溶液;流動相B為0.1%甲酸乙腈;梯度洗脫條件:初始流動相A為95%,保持0.5 min,4.5 min 內降至70%,隨后在4.5 min內降至10%,保持0.5 min后在0.5 min內升至95%,保持2.5 min;流速0.3 mL/min;總運行時間為13 min。

質譜條件:離子源模式采用正負離子模式(ESI+和ESI-);毛細管電壓2.5 kV(ESI+)/-1.5 kV(ESI-);離子源溫度為150 ℃,脫溶劑氣溫度為500 ℃,去溶劑氣流量為1000 L/h,錐孔氣流速為150 L/h。采用多反應監測(Multiple Reaction Monitoring,MRM)模式。

1.2.5 酚類物質的定量分析 分別稱取各酚酸標準品10 mg,配制成1 mg/mL的酚酸標準儲備液,于-20 ℃保存。酚酸混合標準工作液采用梯度稀釋法現用現配。將混合標準品溶液,依次逐級稀釋,配制成一系列質量濃度的混合標準工作液。以峰面積與相應濃度進行線性回歸,得到線性方程和相關系數。樣品分析采用標準曲線法進行定量分析。

1.2.6 抗氧化性測定 DPPH自由基清除能力的測定:取0.2 mL上清液,加入0.3 mL的乙醇,再加入2.5 mL的100 μmol/L DPPH充分混合,室溫避光放置30 min后,測定517 nm下的吸光度值A1。對照采用無水乙醇溶液代替樣品加入2.5 mL的100 μmol/L DPPH溶液中,其余操作同上,517 nm下得到的吸光度值為A0。重復3次。根據以下公式計算樣品對DPPH的抑制率:

DPPH清除能力(%)=(1-A1/A0)×100

式中:A0:未加樣品液時DPPH溶液的吸光度值;A1:加樣品液時DPPH溶液的吸光度值。

鐵還原能力的測定(FRAP):取2.5 mL用40 mmol/L HCl溶解的10 mmol/L TPTZ(Sigma Chemical Co.,St. Louis,MO),2.5 mL的20 mmol/L的FeCl3·6H2O和25 mL 0.3 mol/L醋酸緩沖液(pH3.6)混合得到FRAP溶液。將新鮮配制的FRAP溶液放置于37 ℃水浴中保溫。取120 μL待測溶液,與3.6 mL水浴的FRAP溶液和360 μL去離子水充分混合,在37 ℃水浴中保溫10 min。于593 nm測定反應液的吸光值。空白采用120 μL去離子水代替樣品。樣品反應液的吸光值應在以FeSO4·7H2O為標準品制作的標準曲線范圍之內。樣品鐵還原能力與1 mmol/L FeSO4·7H2O有相同抗氧化能力的量相比較,用μmol Fe2+·g-1·FW表示。

1.3 數據處理

每個樣品設置三個重復,數據用平均值±標準差的形式表示。單因素方差分析(ANOVA)使用統計學軟件SPSS 20.0完成,采用Duncan多重比較進行顯著性方差分析,顯著性水平p<0.05。不同品種櫻桃酚類物質偏最小二乘判別分析利用數據分析網站http://www.metaboanalyst.ca/完成。

2 結果與分析

2.1 不同品種櫻桃果實理化指標分析

5個品種櫻桃果實的單果重、可溶性固形物含量、pH和可滴定酸含量見表1。從表中可以看出,艷陽單果重最大,而23-51最小。艷陽單果重略微小于Ballistreri等的報道[12],研究表明,果實重量除與品種有關外,還與負載量、果實成熟階段等有關[13-14]。可溶性固形物含量和可滴定酸在不同品種間有所差異。其中,薩米脫的可溶性固形物含量最高(18.39 °Brix);可滴定酸變化范圍從0.85%(23-51)～1.15%(瓦列里);而pH變化從3.76～4.01。可滴定酸和pH與文獻報道范圍一致[12,15]。

表1 不同品種櫻桃理化指標(n=3)

2.2 不同品種櫻桃中的酚酸類物質

櫻桃中的酚酸主要以三種形態存在,游離型、游離酯型和結合型。游離型酚酸通過提取可以直接被檢測到,游離酯型和結合型酚酸通常以酯鍵、醚鍵等與許多化合物連接在一起,需要經過水解釋放出來才能被檢測到。酚酸類物質根據結構不同,可以分為羥基苯甲酸類和羥基肉桂酸類。不同品種櫻桃中的酚酸含量見表2。

表2 不同品種櫻桃中的游離型、游離酯型和結合型酚酸含量(mg/kg FW)

游離型酚酸:不同櫻桃品種中共檢出4種游離型酚酸,包括新綠原酸、綠原酸、香草酸和對羥基苯甲酸。櫻桃中的游離型酚酸以新綠原酸含量最高,其次是綠原酸,這與文獻報道一致[5,16-17]。不同品種間酚酸含量差異較大。其中,瓦列里櫻桃中的新綠原酸含量最高(413.81 mg/kg FW),其次為薩米脫,艷陽中含量最低。酚酸含量因品種、栽培模式、果實成熟階段、儲藏條件等不同而有所差異[4,14-15]。此外,櫻桃中還含有較低含量的香草酸和對羥基苯甲酸,這兩種酚酸在23-51中含量最高。

游離酯型酚酸是一種可通過甲醇水溶液直接提取的可溶性成分,但與可溶性糖、多肽等通過酯鍵或醚鍵相連,需要通過水解才能釋放出來[18-19]。游離酯型酚酸總量在瓦列里中含量最高,其次是23-51和薩米脫,彩虹中含量最低。櫻桃中的游離酯型酚酸以咖啡酸為主,這與文獻報道一致[5];5個品種中瓦列里中的咖啡酸含量最高,彩虹中含量最低。除咖啡酸外,彩虹、艷陽和薩米脫中對香豆酸具有較高的含量,而對于23-51和瓦列里,則是原兒茶酸高于其他種類酚酸。研究表明,咖啡酸和對香豆酸均具有較強的抗氧化活性和自由基清除能力[20]。此外,23-51中還含有相對較高含量的香草酸。

結合型酚酸是不可溶性酚酸,不能直接被甲醇溶液提取,多與細胞壁多糖、木質素等通過酯鍵或醚鍵相連,需經水解才能釋放出來[18,21]。櫻桃中共檢測到4種結合型酚酸,包括2種羥基苯甲酸類(香草酸和原兒茶酸)和2種羥基肉桂酸類(咖啡酸和對香豆酸)。23-51中的結合型酚酸總量最高,彩虹中含量最低。與游離酯型酚酸類似,櫻桃中的結合型酚酸同樣以咖啡酸含量最高。結合型的咖啡酸和對香豆酸在文獻中被報道過[5],而原兒茶酸和香草酸是第一次被檢出。

不同形態酚酸在多種水果、谷物麩皮中得到分析[7,22],但關于櫻桃中不同形態酚酸的測定報道較少,目前僅在一篇文獻中被報道過[5],大部分都僅關注了游離型酚酸。從分析結果來看,櫻桃中的游離酯型酚酸可占酚酸總量的38%～51%。游離酯型酚酸在植物抗氧化作用中也發揮著重要作用[18,23]。因此,全面分析酚酸的含量及存在形式,能更好的解釋其生物活性及其營養價值。

2.3 抗氧化性分析

不同形態酚酸提取液DPPH自由基清除能力和鐵還原能力(FRAP)的測定結果如圖1所示(由于結合型酚酸類物質提取液抗氧化特性很低,未在圖中展示)。從圖中可以看出,DPPH自由基清除能力和鐵還原能力測定的抗氧化性結果趨勢一致。結果表明,瓦列里酚酸類物質提取液的DPPH自由基清除能力和FRAP均最高。另外,五個櫻桃品種中,游離型酚類物質提取液的抗氧化性要高于游離酯型的。且抗氧化性指標的測定結果與酚酸類物質含量呈現較高的一致性。

圖1 不同品種甜櫻桃提取液抗氧化性分析

2.4 偏最小二乘判別分析

為了更好的比較不同櫻桃品種間酚酸類物質的差異,以5個櫻桃品種中檢測到的各酚酸物質總量(包括游離型、游離酯型和結合型)為變量進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA),結果如圖2所示。得分散點圖(圖2a)和VIP得分圖(圖2b)共同反應了不同品種櫻桃與酚酸類物質之間的關系。前兩個主成分解釋了總方差的99.0%,其中主成分1占總方差的97.4%。從散點圖可以看出,五個不同櫻桃品種能夠較好的區分開。VIP得分一般用來評價各代謝組分對區分各個品種/處理的貢獻值,從VIP得分圖可以看出,新綠原酸和咖啡酸是區分五個櫻桃品種貢獻最大的物質(一般認為VIP>1的組分對區分組間差異有貢獻),也是造成品種間差異的主要化合物;在五個櫻桃品種中,差異最大的兩個物質新綠原酸和咖啡酸均在瓦列里中含量最高。

圖2 不同品種甜櫻桃中酚酸類物質偏最小二乘判別分析

3 結論

本實驗采用UPLC-MS/MS對五個不同品種甜櫻桃中的不同形態酚酸(包括游離型、游離酯型和結合型)進行了測定和分析。結果表明,不同品種間酚酸總量差異較大。三種形態酚酸中,游離型和游離酯型酚酸占酚酸總量的94%以上,結合型酚酸含量較低。不同櫻桃品種中,游離型酚酸均以新綠原酸為主,游離酯型和結合型酚酸以咖啡酸含量最高。游離型和游離酯型酚酸總量在瓦列里中含量最高(分別為435.69和261.93 mg/kg FW);而對于結合型酚酸,則是在23-51中含量最高(16.92 mg/kg FW)。不同形態酚酸DPPH自由基清除能力和鐵還原能力測定結果與酚酸含量具有一致性。PLS-DA結果顯示新綠原酸和咖啡酸是區分不同甜櫻桃品種貢獻最大的物質。研究結果將為果蔬中不同形態酚酸鑒定及功能性產品開發提供一定的參考價值。