QuEChERS液質聯用法測定禽源性食品中苯基吡唑類殺蟲劑殘留

周 佳,蘇阿龍,朱書強,王麗君,禹 潔

(甘肅省食品檢驗研究院,甘肅蘭州 730000)

苯基吡唑類殺蟲劑是一類吡唑環上取代位和取代基多的化合物,由于其活性強,市場化的吡唑類化合物非常多[1],其中最常見的苯基吡唑類殺蟲劑就是氟蟲腈及其代謝物、氟蟲腈的類似物。氟蟲腈能夠殺滅跳蚤、虱子、蜱蟲、蟑螂、螨蟲等[2-4]。而且氟蟲腈在施用后會產生毒性更強的代謝物:氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈[5-8]。氟蟲腈及其代謝物的危害主要在于人體攝入后會影響神經系統并且會損傷肝臟、甲狀腺等[5,9]。2017年爆發于歐洲的鮮蛋氟蟲腈事件嚴重影響鮮蛋行業有序發展[10]。其實,歐盟早已禁止氟蟲腈在食品產業畜禽養殖中使用,中華人民共和國農業部在2009年也已發布公告明確了氟蟲腈的使用范圍[9，11],GB 2763-2016中對于氟蟲腈的允許使用范圍及限量也有明確要求,氟蟲腈在禽源性食品中是不得檢出。自此行業研發人員開啟了同等效用氟蟲腈類似物的研究序幕。由于氟蟲腈類似物的化學結構與氟蟲腈類似,該類物質也可以達到殺滅跳蚤、虱子、蜱蟲、蟑螂、螨蟲等的作用,目前已市場化的產品就是乙蟲腈和丁烯氟蟲腈。德國拜耳公司開發的乙蟲腈是氟蟲腈的乙基類似物,它的活性比氟蟲腈高,易合成。乙蟲腈是通過破壞中樞神經系統正常活動致死昆蟲[12-13]。丁烯氟蟲腈也是在氟蟲腈基礎上開發出來的新型殺蟲劑,它具有高活性、光譜殺蟲的特點[14]。丁烯氟蟲腈對鱗翅目害蟲具有與氟蟲腈同等的活性,但是有研究表明丁烯氟蟲腈在環境中有移動性而且代謝時間長[15]。綜上,建立同時檢測上述6種苯基吡唑類殺蟲劑的快速方法非常必要。

根據相關文獻報道及標準,氟蟲腈及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜-質譜聯用法(Gas Chromatography-mass Spectrometer)GC-MS[16-20]、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography)LC[21]、液相色譜-質譜聯用法(Liquid Chromatography-mass Spectrometer)LC-MS[22]、氣相色譜法(Gas Chromatography)GC[23-24]、等。乙蟲腈的檢測方法有LC[25]、GC[23-24]、LC-MS[13]等。丁烯氟蟲腈的檢測方法有GC[26-27]、GC-MS[28]、LC-MS[29-30]等。這些檢測方法大都步驟復雜、成本高、耗時長、損失大,研究內容均為氟蟲腈及其代謝物在各種不同基質中的檢測,并無同時檢測多種苯基吡唑類殺蟲劑的方法研究,針對禽源性食品中苯基吡唑類殺蟲劑的研究報道更是空白。

綜上,本方法采用乙腈提取,QuEChERS方法凈化,基于UHPLC-MS/MS的MRM模式,對禽源性食品中6種苯基吡唑類殺蟲劑殘留的分析方法進行研究,以期達到比傳統方法步驟更簡單、回收率更穩定、參數更優化、適用范圍更廣的效果,同時達到填補苯基吡唑類殺蟲劑在禽源性食品中檢測方法的空白,為相關單位制定風險監測方案及市場監管提供參考的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

禽蛋、禽肉、禽內臟 均來自于甘肅各地州市農貿市場;氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、乙蟲腈(標準品) 純度>98%,德國Dr.公司;丁烯氟蟲腈(標準品) 大連瑞澤農藥股份有限公司;乙腈(色譜純) 德國MERCK;乙酸銨、甲酸(色譜純) 美國Fisher公司;N-丙基乙二胺(primary secondary amine)PSA、十八烷基硅膠C18上海安譜實驗科技有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

QTRAP 5500三重四級桿液相-質譜聯用儀(配有電噴霧離子源(ESI)及Analyst?數據處理系統) 美國AB公司;Vortex 3型渦旋振蕩器 德國IKA公司;Avanti J-25落地式高速冷凍離心機 美國BECKMAN公司;純水機 美國thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 禽蛋類樣品:取內容物打散后,用均質機充分均質,分裝入潔凈的容器密封,-20 ℃保存;禽肉及禽內臟類樣品:分解切碎后,用均質機充分均質,分裝入潔凈的容器密封,-20 ℃保存。

1.2.2 樣品前處理 禽蛋類樣品:準確稱取2 g待測樣品于50 mL離心管中,加入乙腈10 mL,搖勻后超聲提取15 min;加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、50 mg C18,渦旋2 min,10000 r/min離心(4 ℃)5 min。移取0.55 mL乙腈層,加入0.45 mL水,渦旋1 min,經0.22 μm有機濾膜過濾,待測。

禽肉及禽內臟類樣品:準確稱取2 g待測樣品于50 mL離心管中,加入5 mL水渦旋分散,加入乙腈10 mL,以下操作同“禽蛋類樣品”。

1.2.3 標準溶液配制 準確稱取標準品氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、乙蟲腈0.01 g(精確至0.0001 g),于10 mL棕色容量瓶中,用乙腈溶解定容,配制成單一的標準儲備溶液(1000 μg/mL),于-20 ℃下保存。按照各化合物的響應不同選擇線性范圍,配制6種苯基吡唑類殺蟲劑的標準混合使用液。準確吸取適量標準混合使用液于10 mL棕色容量瓶中,用55%乙腈水定容即得混合標準溶液系列,2～8 ℃保存7 d。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18Column(規格100 mm×2.1 mm,粒徑1.7 μm);流速0.3 mL/min;柱溫35 ℃;流動相:A(乙腈)+B(水);梯度洗脫條件:0～3.0 min 55%～70% A,3.0～3.5 min 70%～98% A,3.5～5.0 min 98% A,5.0～5.5 min 98%～55% A,5.5～8.0 min 55% A。進樣量5 μL。

1.2.5 質譜條件 離子源:Electron Spray Ionization(ESI);離子化電壓:-4500 V;輔助加熱氣壓力:55 psi;噴霧氣壓力:50 psi;輔助加熱氣溫度:550 ℃;動態多反應監測(MRM)模式;負離子掃描;6種苯基吡唑類殺蟲劑的色譜質譜參數詳見表1。

表1 苯基吡唑類殺蟲劑色譜質譜參數

1.2.6 檢出限和定量限 按照各目標物的響應分別計算信噪比S/N，以3倍信噪比(S/N=3)計算各目標物的檢出限(LOD)，以10倍信噪比計算各目標物的定量限(LOQ)。

1.2.7 加標回收率試驗和精密度試驗 參考六種苯基吡唑類殺蟲劑的定量限，對各目標物選擇3種不同濃度進行加標回收率驗，按照1.2.2進行樣品提取并按照1.2.4和1.2.5的色譜質譜條件分別進樣，每個樣品平行進樣5次，計算回收率和RSD。

1.3 數據處理

將獲得的數據文件導入AB Sciex MultiQuantTM軟件進行數據處理,以各目標物的保留時間作為篩查依據,以離子峰度比作為確證依據，進行定性判斷；同時繪制基質標準曲線對樣品中的各目標物進行定量。

2 結果與分析

2.1 凈化材料優化

針對不同材料的吸附特性(比如,PSA用于吸附雜質中的碳水化合物、脂肪酸、有機酸、酚類和少量的色素;C18用于吸附脂肪和酯類等非極性化合物),結合樣品中雜質的性質,本方法選用C18、C18+PSA對禽源性樣品進行凈化,同時考察凈化材料對目標物的吸附情況。樣品按照1.2.2處理,氟蟲腈及其代謝物、乙蟲腈、丁烯氟蟲腈的添加水平分別為0.10、1.00、2.00 μg/kg,采用基質標準曲線定量。結果顯示,采用單獨C18凈化,6種苯基吡唑類殺蟲劑的回收率在89.6%～117.4%范圍內,RSD為1.8%～4.7%;采用C18+PSA混合凈化,6種苯基吡唑類殺蟲劑的回收率在88.6%～113.1%范圍內,RSD為2.0%～5.5%。綜上,選擇C18作為樣品前處理的凈化材料。進而考察C18的添加量,當樣品量為2 g,C18添加量為50 mg時,譜圖顯示樣品基質噪音降低明顯,繼續增大C18的添加量并沒有明顯的差別,所以選擇50 mg作為前處理步驟中C18的添加量。

2.2 待測液溶劑對響應的影響

采用乙腈作為待測液溶劑,質譜分析后,目標物均出現峰展寬、分叉的現象(如圖1A),這是由于純乙腈的洗脫強度大于乙腈-水,使得目標物出峰變形并且柱效下降,即產生了溶劑效應。為了消除溶劑效應對于目標物響應的影響,本方法將乙腈更換為55%乙腈+45%水,由于該待測液溶劑與流動相相似,所以消除的溶劑效應,分析后6種苯基吡唑類殺蟲劑的峰形有明顯改善,峰形變得尖銳、窄(如圖1B)。綜上,本方法選用乙腈-水(55%+45%)作為待測液溶劑。

圖1 溶劑對苯基吡唑類殺蟲劑峰形的影響

2.3 流動相優化

考慮到流動相對目標物峰形、靈敏度的影響,本方法重點關注了流動相的選擇。選擇六種流動相進行考察:乙腈-水;甲醇-水;乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸);甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸);乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液;甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液。采用100 μg/L的混合標準溶液作為分析對象,各流動相體系下目標物的峰面積比較見表2。大部分苯基吡唑類殺蟲劑在乙腈-水體系中響應高,氟蟲腈砜在甲醇-水體系中響應較高。在甲醇體系中目標物均出現了峰變寬、分叉。在乙酸銨體系中,由于緩沖鹽解離后偏酸性,抑制目標物離子化,導致目標物信號響應降低一倍左右。在甲酸酸化緩沖鹽體系中,由于甲酸的酸性更強,抑制目標物離子化更明顯,目標物的響應降低2～5倍。綜上,選擇乙腈-水作為流動相。

表2 不同流動相下苯基吡唑類殺蟲劑的峰面積

2.4 MS/MS參數的優化

比較正、負離子掃描模式下6種苯基吡唑類殺蟲劑的響應,選擇適合6種苯基吡唑類殺蟲劑的電離方式和分子離子峰。在ESI-模式下,6種苯基吡唑類殺蟲劑的Q1掃描圖中可以清晰的看到同位素峰的存在(圖2),這是因為該類化合物的分子結構中均含有2個Cl原子(自然界中Cl以Cl-35和Cl-37兩種形式存在)的原因。按照目標物響應高且容易獲得(碰撞電壓相對較低)的原則,各選擇2個離子對作為定量、定性離子對。

圖2 6種苯基吡唑類殺蟲劑的Q1全掃描質譜圖

例如氟甲腈,當去簇電壓從0～-300 V變化時,首先由于目標物離子與溶劑分子形成的簇離子隨著電壓的增強而減少,目標物加和離子的響應是逐漸增強的;但是當電壓超過某一個值之后,目標物加和離子的響應出現驟減,這是由于該目標離子的源內裂解造成的。最終選擇-120 V作為氟甲腈的去簇電壓。當碰撞電壓從0～-200 V變化時,首先隨著碰撞電壓的增加,目標物加和離子化學鍵碎裂,目標子離子的響應增強,當電壓超過某一個值時,目標子離子的響應出現明顯的下降,這是由于電壓太大將子離子進一步打碎的結果。最終選擇-18 V作為387.0/351.0的碰撞電壓,選擇-45 V作為387.0/281.9的碰撞電壓。詳細數據見表1。

2.5 基質效應

在液相-質譜分析中,樣品中除目標物之外的其他成分會對目標物的測定造成影響,即基質效應。基質效應按照其對目標物響應的影響分為基質增強效應和基質抑制效應。本實驗參考Gosetti等[31]的方法考察了基質效應,采用三種類型的樣品按照1.2.2前處理,用得到的空白基質溶液分別配制三條基質標準曲線,同時用初始流動相配制溶液標準曲線。計算方法如下:

X(基質效應)=(標準曲線斜率-基質加標曲線斜率)×100/標準曲線斜率。

由表3可知,6種苯基吡唑類殺蟲劑的X<1%,即6種苯基吡唑類殺蟲劑均表現為基質抑制效應。綜上,采用基質標準曲線法進行定量。

表3 苯基吡唑類殺蟲劑的基質效應(%)

2.6 方法學驗證

2.6.1 線性關系與定量限 氟蟲腈及其代謝物的基質標準曲線線性范圍為1～40 μg/kg,決定系數(R2)>0.9980;丁烯氟蟲腈的基質標準曲線線性范圍為10～400 μg/kg,決定系數(R2)>0.9940;乙蟲腈的基質標準曲線的線性范圍為4～160 μg/kg,決定系數(R2)>0.9980。以3倍信噪比(S/N=3)計算各目標物的檢出限(LOD),以10倍信噪比計算各目標物的定量限(LOQ),6種苯基吡唑類殺蟲劑的檢出限為0.02～0.40 μg/kg,定量限為0.06～1.20 μg/kg。(見表4)

表4 苯基吡唑類殺蟲劑的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量限數據

由表4可知,在不同的畜禽樣品中同一個殺蟲劑的檢出限與定量限會有輕微的差別,這是由于基質不同所引起的,但是均可以滿足檢測的需要。

2.6.2 回收率和精密度 本方法采用三類禽源性樣品(禽蛋、禽肉、禽內臟)進行標準添加實驗,向空白禽源性樣品中添加不同水平的氟蟲腈及其代謝物(1#為0.05 μg/kg、2#為0.50 μg/kg、3#為1.00 μg/kg)、丁烯氟蟲腈(1#為1.00 μg/kg、2#為10.00 μg/kg、3#為20.00 μg/kg)和乙蟲腈(1#為0.50 μg/kg、2#為5.00 μg/kg、3#為10.00 μg/kg)。按1.2.2步驟操作,6種苯基吡唑類殺蟲劑的回收率在84.49%～107.86%范圍內,RSD在0.99%～4.19%范圍內。具體數據見表5。

表5 苯基吡唑類殺蟲劑在不同添加水平下的回收率和相對標準偏差(%)

2.7 實際樣品檢測

采用本方法對禽蛋、禽內臟、禽肉進行實際樣品測試,檢出陽性樣品3份。其中1份鮮蛋檢出氟蟲腈,1份雞肉檢出氟蟲腈,1份雞肝檢出氟甲腈。氟蟲腈陽性樣品和10 ng/mL基質標準中6種苯基吡唑類殺蟲劑的特征譜圖見圖3。由圖3可知,A樣品中保留時間與定性、定量離子均與氟蟲腈的基質標準品相匹配,檢出氟蟲腈。

圖3 雞蛋陽性樣品及氟蟲腈標準品的提取離子流圖

3 結論

本方法通過QuEChERS方法凈化,ESI-negative-MRM質譜分析,建立了快速、高效、同時檢測禽源性食品中6種苯基吡唑類殺蟲劑的檢測方法。6種苯基吡唑類殺蟲劑的定量限范圍在為0.06～1.20 μg/kg,在不同線性范圍(1～40、4～160、10～400 μg/kg)下決定性良好(R2>0.994)。

針對6種苯基吡唑類殺蟲劑分別進行三類樣品基質的3水平標準添加測試,回收率達84.49%～107.86%,相對標準偏差為0.99%～4.19%。

QuEChERS方法凈化操作簡單,樣品僅需簡單提取、凈化即可進行上機測試得出結果,前處理的經濟成本與時間成本遠遠低于傳統方法,具有非常好的推廣應用價值。本方法在禽源性食品中得到了很好的應用,但對于植物源性食品的檢測,還需確定其適用范圍和條件進一步研究。該方法的建立相關單位制定風險監測方案及市場監管提供了參考。