大豆多肽營養干預對預防和治療尾吊模擬失重大鼠肌肉萎縮的作用

趙博雅,趙 芬,*,劉新旗,*,張 健,應知偉,韓炳星,曹 元,張義智

(1.北京工商大學食品學院,北京食品營養與人類健康高精尖創新中心, 北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048; 2.中國航天員科研訓練中心,北京 100193; 3.中國農業大學,北京 100193;4.金訶藏藥(山東)健康產業有限公司,山東濟南 250102)

廢用性肌肉萎縮是骨骼肌長期不受負荷引起形態、結構、功能發生改變的一種機體變化,可由禁食[1]、臥床[2]、肢體制動[3]、失神經[4]、失重[4]等原因導致,同時也是心血管病[2]、糖尿病[5]等多種疾病的常見并發癥。根據2016全球疾病負擔報告所述,肌肉相關疾病是影響健康壽命損失年(YLD)的重要因素之一,近十年全球患肌肉相關疾病的人數比九十年代翻了一倍,且年齡標準化率增加60.7%[6]。這一疾病不僅影響患者生活質量,嚴重時可帶來生命危險,也為國家財政帶來沉重負擔。因此尋找合適有效的治療肌肉萎縮的方法或進行早期預防,對臨床醫學、運動醫學和航天醫學等領域[7]具有重要的科學意義及社會意義。

廢用性肌肉萎縮主要表現為肌肉質量和強度的降低、肌纖維變細或消失[8]。大量研究表明,肌肉質量的多少是由蛋白質合成與蛋白質分解動態平衡決定的[9-10]。當分解速率超過合成速率、蛋白質凈生成量減少時,發生肌肉萎縮。蛋白質代謝信號通路的核心物質是Akt(蛋白激酶B,PKB)[11]。控制蛋白質合成的重要途徑是由IGF-1介導的IGF-1/PI3K/Akt/mTOR,可激活下游信號4EBP1和S6K1轉導,調節蛋白質的翻譯作用[12-13],促進蛋白質合成[14]。控制蛋白質分解的兩條重要途徑有泛素蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑,其中肌肉萎縮相關基因和萎縮基因均由Akt的下游FoxO3控制[15-16]。當它具有活性時,可從細胞質自由進入核中,與MAFbx/Atrogin-1和MuRF1基因的多個啟動子相互作用[17],增加這兩種泛素連接酶E3的表達,促進由二者催化的泛素蛋白酶體途徑的進行[18],或通過影響溶酶體自噬途徑[19],加速蛋白質分解。此外,肌肉萎縮的發生也會伴隨氧化應激的出現。此時,機體內抗氧化物酶如SOD、GSH-Px濃度降低,ROS大量增多至超過機體處理能力,直接或間接導致蛋白質損傷,使細胞、組織或器官受損[20]。

目前,除運動及功能訓練外,治療肌肉萎縮的方法主要有藥物干預和營養干預。藥物包括激素類(如生長激素[21]、胰島素樣生長因子[22])、中藥類(川芎[23]、丹參、黃芪[24])、抗氧化劑類(維生素E[25])等。但由于可能具有的潛在副作用,還需大量毒理實驗證實,因此營養干預方法受到越來越多的人們廣泛的關注。這些營養干預方法普遍從增加蛋白質合成、減少蛋白質分解或改善氧化應激等[26]方面緩解肌肉萎縮癥狀。Beasley、夏志等[27-28]研究表明,攝入富含亮氨酸等支鏈氨基酸的優質蛋白如乳清蛋白,可改善骨骼肌丟失的狀況并可減輕體內引發的炎癥反應。Bueno等[29]發現,給予病人包含益生元的營養組合物,可增加HMB內源性產生,進而增加mTOR濃度從而促進蛋白質合成。Murata等[30]發現攝入花翠素可通過抑制MuRF-1表達起到預防肌肉萎縮的作用。Valcarce等[31]研究發現,給予小分子PPAR-δ可通過增加肌纖維的線粒體密度增強有氧能力[32],治療肌肉萎縮。

大豆多肽是大豆蛋白酶解成的小分子產物,必需氨基酸齊全且平衡,同時較大豆蛋白更易消化吸收,因而具有廣闊的應用前景[33]。目前關于大豆多肽對機體的功能性研究主要集中在抗氧化[34]、治療燒傷[35]、降血脂[36]、降血壓[37]、調節血糖[38]等方面,對蛋白質合成和分解的作用鮮有報道。因此,本文通過建立大鼠尾吊模型模擬失重,對大豆多肽對蛋白質代謝和氧化應激的影響進行深入探討,以期為營養干預預防和治療肌肉萎縮的方法提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級8周齡Wistar雄性大鼠(動物許可證號:SCXK(京)2016-0006,體質量260～280 g) 北京維通利華實驗動物技術有限公司;大鼠維持飼料 斯貝福(北京)生物技術有限公司;大豆多肽(蛋白含量90%) 諾利如一(安陽)生物科技有限公司;IGF-1 ELISA檢測試劑盒、FoxO3 ELISA檢測試劑盒、SOD ELISA檢測試劑盒 北京方程生物科技有限公司;普通RIPA裂解液(組織/細胞) 北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量分析試劑盒、ECL免疫印跡底物 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;兔抗MAFbx/Fbx32/Atrogin-1單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG 艾博抗(上海)貿易有限公司。

玻璃勻漿器 北京半夏科技發展有限公司;Allegra X-30R離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;Infinite M200 Pro多功能酶標儀 帝肯(上海)貿易有限公司;PowerPac通用電泳儀、Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉印系統、ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統 伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及灌胃設計 將35只大鼠分籠飼養,每天晝夜循環光照12 h,環境溫度20～25 ℃,相對濕度50%～60%。自由進食進水,每天更換飼料和飲水。適應性喂養1周后,隨機選取15只用于驗證大豆多肽預防作用實驗,設為地面-對照組1(C1)、尾吊-對照組(M)、尾吊-肽組(T),每組5只,灌胃40 d;剩余20只用于驗證大豆多肽治療作用實驗,其中隨機選取5只作為地面-對照組(C2),15只進行尾吊。飼養40 d后,將15只尾吊大鼠放回地面,分為尾吊后-高劑量肽治療組(HT)、尾吊后-中劑量肽治療組(MT)、尾吊后-低劑量肽治療組(LT),每組5只,與C2共同灌胃60 d。參照Morey-Holton E等[39]的方法進行尾部懸吊,使大鼠后肢離地30 °、前肢可自由活動,隨大鼠生長及時調節尾吊高度。按照人體每天額外補充5 g大豆多肽進行換算得到大鼠每天補充量并以此作為治療中劑量,即0.45 g/(kg·BW·d),治療高劑量和低劑量分別設為0.75 g/(kg·BW·d)和0.15 g/(kg·BW·d)。預防劑量設為0.30 g/(kg·BW·d)。所有大鼠均按照0.50 mL/(kg·BW·d)進行灌胃,對照組灌胃蒸餾水。

1.2.2 血清和肌肉樣品采集 預防實驗中,于5、10、17、25、32、40 d稱量大鼠體質量并記錄。治療實驗中,每周第4 d和第7 d稱量大鼠體質量并記錄,并于7、21、35 d進行尾靜脈取血。預防實驗灌胃40 d時,對C1、M、T組進行解剖。治療實驗灌胃60 d時,對C2、HT、MT、LT組大鼠進行解剖。解剖前禁食不禁水12 h。解剖時,麻醉后采用腹主動脈法取血。將血液室溫靜置1～2 h,于4 ℃放置一夜。次日4 ℃、3000 r·min-1離心10 min,取上層血清,-80 ℃保存備用。取大鼠左側后肢腓腸肌和比目魚肌,分別稱量腓腸肌和比目魚肌濕重并計算腓腸肌和比目魚肌濕重/體質量比:腓腸肌或比目魚肌濕重/體質量比(mg/g)=腓腸肌或比目魚肌濕重/大鼠體質量,于-80 ℃凍藏備用。

1.2.3 血清相關指標測定 采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗檢測大鼠血清中IGF-1、FoxO3、SOD濃度。向包被對應待測物捕獲抗體的微孔中依次加入標準品/樣品、HRP標記的檢測抗體,37 ℃溫育1 h,洗滌未結合的抗原抗體。加入底物TMB于37 ℃避光孵育30 min進行顯色,用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品中對應待測物濃度。

1.2.4 總蛋白提取及蛋白定量 取0.1 g肌肉組織剪碎,加入1 mL RIPA裂解液(PMSF濃度為1 mmol/L),在冰水浴條件下用玻璃勻漿器研磨10 min,冰上裂解30 min。于4 ℃、12000 r·min-1離心10 min,收集上清即提取的總蛋白,制得肌肉勻漿樣品,于-80 ℃保存備用。采用BCA法對各個樣品進行蛋白定量,BSA蛋白標準曲線為:y=0.6892x+0.0100,決定系數R2=0.9991。最終將樣品統一稀釋成同一蛋白濃度。

1.2.5 Western Blot分析 將樣品于100 ℃煮沸5 min使蛋白充分變性,采用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,濃縮膠濃度為5%。初始電壓為80 V,20 min后將電壓調至120 V,約1 h停止。將膠上蛋白轉移至PVDF膜,5% BSA中(溶于TBST)于37 ℃封閉2 h,在1∶1000稀釋的一抗中于4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,每次5 min。加入HRP標記的二抗于37 ℃孵育2 h,TBST洗膜3次,每次5 min。加入ECL化學發光底物對條帶進行染色,避光結合2 min,在凝膠成像儀中對目的蛋白Atrogin-1和內參蛋白GAPDH進行顯影,利用Image Lab軟件對圖像進行分析。實驗重復3次。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 大豆多肽營養干預對大鼠肌肉萎縮的預防作用

2.1.1 大豆多肽對大鼠體質量、肌肉濕重及肌肉濕重/體質量比的影響 由圖1A可知,各組大鼠初始體質量無顯著性差異。隨飼養時間延長,與C1組相比,M和T組體質量增長趨勢明顯減緩,10 d后,M和T組體質量顯著低于C1(p<0.05)。尾吊時,由于后肢活動減少導致能量消耗減少、攝食減少,機體無法正常合成蛋白,不能滿足身體生長需要,因此與C1組相比,M組大鼠肌肉質量減少、體質量減輕。5～10 d時,M和T組體質量穩步增加;10～25 d時,M組體質量增長平緩,T組仍保持一定速度持續增長,且在17～25 d期間,T組體質量增長速率提升較快、體質量超過M組,但無顯著性差異。將三組大鼠在預防實驗始末的平均體質量變化量進行對比發現(圖1B),M組體質量增長量顯著低于C1組(p<0.05),T組體質量增長量較M組有一定提升,但未達到統計學水平上的顯著性差異。大豆多肽營養干預為機體提供了外源蛋白質,作為合成身體生長所需蛋白質的原料,因而可在一定程度上改善大鼠體質量增長緩慢問題。

圖1 預防實驗大豆多肽營養干預對大鼠體質量(A)和體質量變化量(B)的影響

肌肉濕重是衡量肌肉萎縮程度最常用的指標之一[40]。由圖2A可知,M組腓腸肌濕重和比目魚肌濕重均顯著低于C1(p<0.05),表明大鼠發生肌肉萎縮,尾吊模型建立成功。由圖2B可知,M組腓腸肌濕重/體質量比顯著低于C1組(p<0.05),但比目魚肌濕重/體質量比與C1無顯著性差異,這可能是由于比目魚肌質量小造成的。同時說明,因尾吊導致的體質量減少量中,腓腸肌濕重減少占大部分。

圖2 預防實驗大豆多肽營養干預對大鼠肌肉濕重(A)及肌肉濕重/體質量比(B)的影響

2.1.2 大豆多肽對蛋白質合成代謝和分解代謝相關因子及蛋白表達水平的影響 當蛋白質合成代謝通路中IGF-1濃度升高時,依次激活PI3K、Akt、mTOR使其磷酸化[12-13],蛋白質合成速率增加;同時,Akt下游FoxO3發生去磷酸化、活性被抑制[15-16],分解速率降低。反之,當IGF-1濃度降低時,PI3K和Akt的磷酸化水平降低,FoxO3磷酸化水平升高,蛋白質合成速率降低、分解速率提升。

由圖3可知,與C1相比,M組大鼠血清中IGF-1濃度顯著降低(p<0.05),血清中FoxO3濃度顯著升高(p<0.05),腓腸肌和比目魚肌中Atrogin-1蛋白相對表達量顯著升高(p<0.05)。與M相比,T組大鼠血清中IGF-1濃度顯著升高(p<0.05),血清中FoxO3濃度顯著降低(p<0.05),比目魚肌中Atrogin-1蛋白相對表達量顯著降低(p<0.05)。這一結果表明,尾吊使蛋白質合成速率降低、分解速率增加,導致大鼠腓腸肌和比目魚肌質量減少,發生肌肉萎縮。大豆多肽營養干預可減輕這一現象的發生程度,增加機體中蛋白質合成、抑制比目魚肌中蛋白質加速分解,減輕尾吊對蛋白質代謝造成的影響,但對腓腸肌無明顯作用。

圖3 預防實驗大豆多肽營養干預對大鼠血清中IGF-1(A)和FoxO3(B)濃度及肌肉中Atrogin-1蛋白相對表達量(C)(D)的影響

2.1.3 大豆多肽對機體氧化應激水平的影響 SOD是一種含金屬的酶,可清除體內代謝產生的過多的超氧陰離子自由基[41],使氧化產物維持在相對穩定的數量狀態,延緩由于自由基累積侵害導致的機體衰老,間接影響蛋白質代謝。由圖4可知,與C1相比,M組大鼠血清中SOD濃度顯著降低(p<0.05)。與M相比,T組血清中SOD濃度有所提高,但未達到統計學水平上的顯著性差異,與C1也無顯著性差異。由此說明,尾吊造模使大鼠體內抗氧化物酶濃度降低,氧化產物積累較多至超過機體的抗氧化能力,導致氧化應激水平升高。大豆多肽營養干預可在一定程度上提高抗氧化物酶濃度,最終與機體內氧化產物達到平衡,減少體內氧化應激反應。

圖4 預防實驗大豆多肽營養干預對大鼠血清SOD濃度的影響

2.2 大豆多肽營養干預對大鼠肌肉萎縮的治療作用

2.2.1 大豆多肽對大鼠體質量、肌肉濕重及肌肉濕重/體質量比的影響 由圖5A可知,通過40 d尾吊造模,HT、MT、LT三組大鼠在治療時的初始體質量顯著低于C2(p<0.05);LT略高于HT和MT,這可能是由于個體差異造成的。在治療期間,C2組大鼠體質量增長較為平緩,HT、MT、LT三組增長速度較快。治療60 d結束時,四組大鼠體質量無顯著性差異。通過對比圖5B治療始末四組大鼠的平均體質量變化量發現,HT、MT、LT的體質量增長量均顯著高于C2(p<0.05)。結果表明,不同劑量的大豆多肽可提高大鼠體質量增長速率,使發生肌肉萎縮的大鼠逐步恢復正常生長。

圖5 治療實驗大豆多肽營養干預對大鼠體質量(A)及體質量變化量(B)的影響

由圖6可知,治療60 d結束時,HT、MT、LT三組大鼠腓腸肌和比目魚肌濕重及濕重/體質量比與C2組均無顯著性差異。這一結果表明,不同劑量大豆多肽營養干預可使發生肌肉萎縮大鼠損失的肌肉質量提升至恢復正常。

圖6 治療實驗大豆多肽營養干預對大鼠肌肉濕重(A)及肌肉濕重/體質量比(B)的影響

2.2.2 大豆多肽對蛋白質合成代謝和分解代謝相關因子及蛋白表達水平的影響 由圖7A和圖7B可知,治療7 d時,HT、MT、LT三組大鼠血清中IGF-1濃度與尾吊造模第40 d時的M相比幾乎無變化且均顯著低于C2(p<0.05);三組大鼠血清中FoxO3濃度與M相比有一定程度降低,但HT和LT仍顯著高于C2(p<0.05)。隨治療時間延長,HT組大鼠血清中IGF-1濃度有一定程度提高,HT和LT組大鼠血清中FoxO3濃度顯著降低(p<0.05)。治療末期,HT、MT、LT三組大鼠血清中IGF-1和FoxO3濃度與C2均無顯著性差異。結果表明,不同劑量的大豆多肽可提升肌肉萎縮大鼠機體內蛋白質合成代謝速率,減緩蛋白質分解代謝速率。營養干預一段時間后,發生肌肉萎縮的大鼠體內蛋白質合成和分解代謝可重新達到平衡。此外,推測大豆多肽營養干預對大鼠肌肉萎縮的治療作用首先表現在抑制蛋白質分解,而后對促進蛋白質合成產生作用。

圖7 治療實驗大豆多肽營養干預對大鼠血清中IGF-1(A)和FoxO3(B)濃度及肌肉中Atrogin-1蛋白相對表達量(C)(D)的影響

由圖7C和圖7D可知，治療60 d后，MT和LT組大鼠腓腸肌中Atrogin-1蛋白相對表達量與C2組相比無顯著性差異，HT組顯著高于C2組(p<0.05)。同時，MT和LT組大鼠比目魚肌中Atrogin-1蛋白相對表達量與C2組相比無顯著性差異，HT組顯著低于C2組(p<0.05)。結果表明，中低劑量的大豆多肽可抑制肌肉中蛋白質分解，同時由于蛋白質合成作用增強，導致蛋白質凈生成量增多，因此中低劑量組腓腸肌和比目魚肌濕重提高，肌肉質量恢復正常。高劑量大豆多肽對快肌和慢肌的作用并不相同，其可抑制比目魚肌中蛋白質分解、增強腓腸肌中蛋白質分解。但結合圖6得知，治療60 d后，HT組腓腸肌濕重及濕重/體質量比與C2組無顯著性差異，因此推測治療期間高劑量大豆多肽對增強腓腸肌中蛋白質合成的作用更顯著。

2.2.3 大豆多肽對機體氧化應激水平的影響 由圖8可知，治療初期，MT組大鼠血清中SOD濃度與M相比顯著提高(p<0.05),但仍顯著低于C2(p<0.05)，HT和LT組與M相比無明顯變化。治療21 d時，MT和LT組大鼠血清中SOD濃度與M相比極顯著提高(p<0.01)且與C2無顯著性差異。治療后期35～60 d期間，HT組大鼠血清中SOD濃度與M相比極顯著提高(p<0.01)且與C2無顯著性差異。這一結果表明,中低劑量大豆多肽在短期內能提高大鼠體內抗氧化物酶濃度,高劑量大豆多肽可逐步提高抗氧化物酶濃度,使機體氧化應激水平降低。

圖8 治療實驗大豆多肽營養干預對大鼠血清SOD濃度的影響

3 結論

本研究表明,大豆多肽營養干預為機體提供了良好的外源蛋白質,可提高大鼠體質量增長速率,通過增強蛋白質合成、減弱蛋白質分解代謝提高腓腸肌和比目魚肌濕重,同時降低體內氧化應激水平,在一定程度上能有效預防肌肉萎縮的發生或治療修復肌肉損傷。因此,大豆多肽對廢用性肌肉萎縮的預防和治療作用具有重要的研究價值和廣闊的應用前景。在后續研究中,大豆多肽預防和治療肌肉萎縮的作用機制仍有待進一步實驗探討,如大豆多肽是否對細胞增殖有作用、是否在提升抗氧化酶濃度同時減少氧化物積累等,以期為大豆多肽營養干預預防和治療肌肉萎縮的方法提供更詳盡的科學依據。