脫酚及pH偏移處理對菜籽蛋白體外模擬消化的影響

孫雪梅,蔣 將,劉元法

(江南大學食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

油菜籽作為世界上第三大油料作物,在我國每年年產量均居第一。菜籽粕作為油脂加工的副產物,其蛋白含量較高,是一種豐富的植物蛋白資源。且菜籽蛋白具有平衡的氨基酸模式,含硫氨基酸的含量高于大豆蛋白[1]。但目前菜籽粕主要用作動物飼料或肥料,而限制菜籽蛋白在人類食品中應用的主要原因是存在抗營養因子,如植酸、硫苷、芥子酸、酚類物質及纖維等[2]。盡管引入了“雙低菜籽”品種,但高含量的多酚和植酸依然是限制菜籽蛋白在食品中應用的重要因素[3]。多酚在堿性pH條件下,氧化形成醌類物質,與蛋白共價結合,從而導致蛋白溶液呈現墨綠色[4]。此外,多酚-蛋白復合物的形成還會降低菜籽粕的消化率[5]。因此,降低和脫除菜籽粕中的抗營養因子對提高菜籽蛋白的應用具有重要意義,同時脫酚后蛋白加工功能性有待進一步研究。

研究表明,通過一定的加工技術降低抗營養因子水平,可顯著提高雙低菜籽粕及其蛋白質在動物飼料中的消化率。其中,多酚對菜籽粕及蛋白的消化性質也起到重要作用。Qiao等[6]研究發現盡管菜籽中芥子酸對肉食雞沒有明顯的毒性,但高含量下會影響氨基酸的消化率。Serraino等[7]的研究結果表明菜籽中酚酸的脫除能夠增加氨基酸的釋放速率。一方面,多酚可通過氫鍵、疏水相互作用及共價結合方式與蛋白形成復合體,從而降低蛋白的營養價值;另一方面,單寧也會阻礙消化酶的作用,影響蛋白水解[8]。

pH偏移作為一種有效的蛋白改性方法,通過將蛋白在強堿條件下維持一段時間后再將其調至中性,從而誘導球體蛋白進入“熔球態”,即蛋白質保持相對緊湊的結構(即保留大多數二級結構)但往往會失去一些三級結構的狀態。處于“熔球態”中的蛋白,其溶解度、乳化性及抗氧化性質能夠得到明顯改善[9]。

本文采用體外模擬胃腸消化模型,通過水解度、蛋白電泳及微觀結構等來研究脫酚及pH偏移處理對菜籽蛋白及蛋白乳液體系消化性的影響,從而為菜籽蛋白在食品領域的進一步開發與應用提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘藍型雙低脫皮油菜籽 中國農業科學院油料作物研究所;大豆油 無錫歐尚超市;胃蛋白酶(3000 U/mg)、胰蛋白酶(2500 U/mg)、脂肪酶(100～500 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 國藥集團化學試劑有限公司;乙醇、正己烷等試劑 均為分析純。

5804R離心機 德國Eppendorf公司;FE28 pH計 梅特勒公司;Nano Brook Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀 美國布魯克海文儀器公司;DM2700P偏光顯微鏡 德國徠卡公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酚類化合物的脫除 將脫皮菜籽粉碎后,過80目篩,用正己烷-乙醇(10∶1,v/v)混合溶劑脫脂。根據Vuorela等[10]的方法對脫脂菜籽粉進行脫酚處理,略作修改。稱取一定量的脫脂菜籽粕,以物料比1∶10 (w/v)加入有機試劑提取酚類化合物,鑒于食品安全要求,用70%乙醇(Et)室溫下攪拌1 h,真空抽濾,將抽濾后的菜籽粕置于通風櫥過夜,待提取蛋白。

1.2.2 菜籽分離蛋白的制備 根據Pirestani等[11]的方法提取菜籽分離蛋白,并作適當修改。稱取一定量的脫酚菜籽粉,分散于去離子水中,料水比為1∶10 (w/v),用2 mol/L的NaOH調節pH至11.0,室溫攪拌2 h后在8000×g,4 ℃離心30 min。用2 mol/L的HCl將上清液調至pH4.5,靜置30 min,5000×g 離心20 min。將沉淀水洗3次,調節pH至7.0,冷凍干燥,得到蛋白Et,未脫酚處理提取的蛋白為C。參照GB 5009.5-2016,采用凱式定氮法測定蛋白質含量。

1.2.3 pH偏移處理 參照Jiang等[9]的方法,配制濃度為20 mg/mL的菜籽分離蛋白溶液。用2 mol/L NaOH調節pH至12.0,室溫下攪拌1 h,隨后用2 mol/L HCl再將其調回pH7.0,攪拌1 h。由C和Et處理后分別得到C12、Et12。對照組加入相應摩爾量的NaCl溶液。

1.2.4 蛋白體外模擬消化 參照Kaur等[12]的方法,將脫酚及pH偏移處理的蛋白溶液(6 mg/mL)用1 mol/L HCl調至pH2.0,加入胃蛋白酶(酶/底物1∶20,溶于0.1 mol/L HCl),在37 ℃恒溫攪拌1 h。反應結束后,立即用0.9 mol/L NaHCO3將蛋白水解產物調至pH5.3,隨后用1 mol/L NaOH繼續調節pH至7.0,加入胰蛋白酶(酶∶底物=1∶20,溶于磷酸鹽緩沖溶液),在37 ℃恒溫反應1 h。蛋白水解期間,分別收集0、30、60、90及120 min的蛋白水解樣品,沸水浴5 min滅酶。將樣品置于-18 ℃保存用于進一步分析。

1.2.4.1 水解度測定 采用OPA(鄰苯二甲醛)法[13]測定蛋白水解度。將7.620 g硼砂和200 mg十二烷基硫酸鈉(SDS)溶于150 mL去離子水中,使其完全溶解。稱取160 mg OPA試劑溶于4 mL無水乙醇,并轉移到上述溶液。將176 mg 1,4-二巰基蘇糖醇(DTT)加入到上述溶液中,定容至200 mL。配制0.1 mg/mL的絲氨酸標準樣品,取400 μL標準樣品與待測水解樣品分別與3 mL OPA試劑混勻,以去離子水作空白,準確反應2 min,在340 nm處測定吸光值。

其中:OD:吸光值;X:樣品重量(g);P:樣品中蛋白含量(%);0.9516:絲氨酸標準溶液中的絲氨酸-NH2(meqv/L,毫當量每升);0.1:樣品體積轉換為L,由凱式定氮法測得。

其中:α=1.00,β=0.40。

其中:h0:水解反應前樣品相對原始底物的水解度值;h1:水解反應后樣品相對原始底物的水解度值;htot=7.8。

1.2.4.2 消化率測定 通過測定水解產物的可溶性蛋白濃度表征蛋白消化率。取1 mL水解產物與1 mL三氯乙酸(TCA)溶液(20%,w/v)混合,10000×g離心10 min,收集上清液,并用10% TCA溶液適當稀釋,于280 nm處測定吸光值,使樣品吸光值在保持在標曲范圍內。以牛血清蛋白做標曲,得線性回歸方程為:

y=0.5869x+0.0008,R2=0.9994。

其中:y為吸光值,x為標品濃度(mg/mL)。

根據線性回歸分析上清液中可溶性蛋白濃度。

其中:C:樣品蛋白濃度(mg/mL);OD樣品:水解后的上清液樣品吸光值;0.5869,0.0008:由牛血清標曲所得的參數;n:樣品稀釋倍數。

1.2.4.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據Sch?gger等[14]的方法稍作修改,制備聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠與分離膠濃度分別為4%和16%(w/v)。將水解樣品溶解于上樣緩沖液(25 mL 0.5 mol/L Tris,20 mL甘油,40 mL 10% SDS,15 mL水,pH6.8),使蛋白最終濃度為2 mg/mL,上樣量為15 μL。電泳在恒定電壓下進行:初始電壓30 V,進入分離膠時電壓為100 V。

1.2.4.4 ABTS+·清除率 參照Ma等[15]的方法測定ABTS+·清除率。將7 mmol/L ABTS儲備液和2.45 mmol/L高硫酸鉀(最終濃度)混合,在室溫、避光條件下靜置12～16 h,形成ABTS自由基工作液。將工作液用0.2 mol/L PBS(pH7.4)稀釋,使其在734 nm處的吸光度值為0.70±0.02。取20 μL蛋白水解樣品與1980 μL工作液混合反應10 min,在734 nm處測定吸光值。以Trolox做標準曲線,得線性回歸方程為:

y=0.3844x+0.001,R2=0.9971。

其中:y為吸光值,x為標品濃度(mmol/L)。

根據線性回歸分析,結果以Trolox當量(mmol/L)表示。

1.2.4.5 DPPH自由基清除率的測定 基于Zhou等[16]描述的方法。將1.5 mL的蛋白水解樣品與等體積0.1 mmol/L DPPH溶液混合。振蕩搖勻并在室溫下反應30 min,在517 nm處測定吸光度。以Trolox做標準曲線,得線性回歸方程為:

y=0.0233x+0.0216,R2=0.9985。

其中:y為吸光值,x為標品濃度(μmol/L)。

根據線性回歸分析,結果以Trolox當量(μmol/L)表示。

1.2.5 蛋白乳液制備 將菜籽分離蛋白配制成濃度為10 mg/mL的蛋白溶液,與大豆油以1∶3 (v/v)的比例混合,用Ultra-Turrax高速分散機在13500 r/min的剪切速率下剪切2 min進行預乳化。然后將乳狀液用AH-2010高壓均質機在30 MPa壓力下均質3次。

1.2.6 乳化性質的測定 將1.2.5中剪切過的預乳液迅速倒入25 mL小燒杯中,立即從距燒杯底部5 mm處取20 μL乳狀液于試管中,在試管中加入5 mL 0.1%(w/v)SDS溶液,混勻后于500 nm處測定吸光度值A0;靜置30 min重新取樣測定吸光度值A30,以0.1% SDS溶液做空白對照。

其中:N:稀釋倍數;C:乳化液形成前蛋白溶液中蛋白質濃度(g/mL);φ:乳化液中油的體積分數(L/L);A0:0 min時乳液的吸光值;A30:30 min時乳液吸光值。

1.2.7 乳液模擬體外消化 乳液體外模擬消化參照Xu等[17]的方法略作修改。將40 mL乳液與等體積的模擬胃液(胃蛋白酶3.2 g,NaCl 2 g,HCl 7 mL,定容至1 L)混合,再用1.0 mol/L HCl溶液調至pH2.0,37 ℃恒溫攪拌1 h,隨后用2 mol/L NaOH調至pH7.0,終止反應。取出40 g水解產物,加入10 g模擬小腸液(脂肪酶1.6 mg/g,胰蛋白酶1.0 mg/g,膽鹽10 mg/g,均為最終濃度),在37 ℃條件下繼續攪拌1 h。反應結束后,沸水浴5 min滅酶。

1.2.7.1 微觀結構 將乳液用去離子水稀釋5倍,混勻,取一滴樣品置于載玻片上,緩慢放置蓋玻片,避免起泡,用DM2700P偏光顯微鏡的普通光學模式(物鏡20×,目鏡10×)下觀察乳液油滴分布及聚集情況。

1.2.7.2 粒徑測定 將乳液用去離子水稀釋500倍,采用多角度粒度分析儀測定乳液粒徑,分散相折射率為1.330,分散質折射率為1.492,測定溫度為25 ℃。

1.3 數據處理

所有實驗均重復2～3次,并且至少3次平行,結果表示為“平均值±標準偏差”形式。顯著性分析采用SPSS 21.0通過Duncan法進行評估(p<0.05)。圖表由Origin 8.0軟件制作。

2 結果與分析

2.1 脫酚及pH偏移對蛋白體外消化的影響

2.1.1 水解度 蛋白水解度的變化通常用來解釋蛋白消化率。脫酚及pH偏移處理的菜籽蛋白經過體外模擬胃腸消化后,消化產物的水解度變化如表1。隨消化時間的延長,所有樣品的蛋白水解度呈上升趨勢。經過60 min胃蛋白酶水解后,C和C12的水解度相較于脫酚處理的樣品(Et及Et12)分別提高了39.2%和68.4%,這表明蛋白經過脫酚處理后抑制了蛋白在胃消化階段的水解。然而經過1 h(60～120 min)胰蛋白酶水解后,脫酚處理的樣品(Et、Et12)水解度相較于空白(C、C12)分別增加了17.1%和22.9%，表明酚的脫除促進了蛋白在小腸階段的水解。

可能的原因是脫酚處理促進了蛋白結構的展開,進一步誘導疏水聚集,掩蓋了胃蛋白酶與蛋白的結合位點,從而使脫酚蛋白在胃蛋白酶消化階段的水解較緩慢[18]。經過1 h的胃消化,誘導蛋白結構一定程度上被破壞。與空白相比,前期脫酚處理和pH偏移處理均使得蛋白結構更加松散,因此更有助于胰蛋白酶的消化。總的來說,菜籽蛋白中內源酚的存在會降低蛋白的消化率。此外,單純的pH偏移處理對蛋白消化率無顯著影響(p>0.05),但pH偏移處理結合脫酚處理可大大增加蛋白的消化率。

2.1.2 體外消化率 不同消化時間的蛋白消化產物通過TCA沉淀,其上清液中可溶性蛋白的濃度變化如圖1。蛋白的原始濃度為6 mg/mL,未經蛋白酶消化前,TCA沉淀后的上清液蛋白濃度約為0.7 mg/mL,胃蛋白酶水解后,上清液中可溶性蛋白濃度顯著增大到5 mg/mL左右。胃蛋白酶水解過程中(30～60 min),所有脫酚樣品(Et和Et12)的可溶性蛋白濃度均低于其對應的空白樣品，與水解度變化相同。僅pH偏移處理的樣品(C12)與空白沒有差異。即脫酚處理誘導的蛋白可溶性聚集阻礙了胃蛋白酶的水解,pH偏移處理對胃蛋白酶的水解無顯著影響。而經過1 h的胰蛋白酶水解后,可溶性聚集被破壞,脫酚處理及胃蛋白酶的水解均促進了蛋白結構的展開,Et的可溶性蛋白濃度顯著提高(p<0.05),比對照組提高了22.3%,這與蛋白水解度的變化趨勢一致。同樣的,pH偏移在胰蛋白酶水解階段影響較小。

圖1 脫酚及pH偏移處理對CPI體外模擬消化產物可溶性蛋白濃度的影響

2.1.3 SDS-PAGE 為了進一步考察體外模擬消化時蛋白酶對不同方式處理的蛋白亞基組成的影響,進行非還原SDS-PAGE分析(圖2)。菜籽蛋白主要由12S(α和(亞基)和2S亞基組成,且2S(16 kDa)與12S(49 kDa)均由二硫鍵連接[19]。對于未經消化的天然CPI,脫酚處理可能會暴露更多的含硫氨基酸并促進二硫鍵的形成,因此,在電泳中表現出16 kDa條帶的強度增加。經過胃蛋白酶水解后,所有亞基含量均減少,且在10 kDa處生成新的亞基。其中12S中(亞基在未脫酚組CPI(C和C12)明顯減少,在脫酚組(Et和Et12)完全消失。經過胰蛋白酶消化,10 kDa亞基條帶,未脫酚組濃度明顯降低,脫酚組消失。與C相比,C12中2S和12S亞基含量均減少。但對于脫酚后樣品,pH偏移處理對消化性無明顯影響。總的來說,脫酚處理對蛋白消化性變化起到主導作用。這說明脫酚后蛋白結構發生一定程度展開,且原有的酚與蛋白的結合位點暴露出來,更有利于其與蛋白酶的結合。Duodu等[18]曾報道酚與蛋白結合形成復合物,并且酚類物質也具有一定的空間位阻效應,這都會阻礙酶對蛋白的作用。但脫酚結合pH偏移處理后蛋白展開程度較脫酚處理明顯增大,且大量的疏水基團暴露誘導蛋白發生可溶性聚集[9],因此蛋白水解度顯著增大(表1),但電泳結果沒有顯現出來,有可能是水解成較小分子量的肽,無法在電泳中顯示。

圖2 脫酚及pH偏移處理對CPI體外模擬消化產物SDS-PAGE的影響

2.1.4 消化產物抗氧化性質 酚類物質一般具有較好的抗氧化性。蛋白自身也具有一定的抗氧化性,pH偏移處理后的蛋白由于結構展開,疏水基團暴露,抗氧化性明顯增大[20]。脫酚及pH偏移處理后的蛋白體外消化產物的ABTS+·及DPPH自由基清除能力如圖3所示。在整個消化過程中,ABTS+·及DPPH自由基清除能力均呈先增加后降低的趨勢,且在胃蛋白酶水解60 min后達到最大值。類似的結果也曾被Zhou等[16]和Phongthai等[21]報道過。在圖3A中,脫酚處理使得Et蛋白的ABTS+·清除能力降低了69.9%,然而pH偏移處理后的C12提高了172%,脫酚后的樣品再經pH偏移處理,其抗氧化性大大增強(80.6%)，這表明蛋白中酚的存在具有重要的抗氧化活性。同時,pH偏移促進了蛋白結構的部分展開,暴露了更多的氨基酸側鏈基團及肽,提高了蛋白的自由基清除能力,彌補了脫酚后抗氧化性降低的缺陷。Jiang等[20]在豌豆蛋白中也發現了類似的結果。經過胃蛋白酶水解,消化產物的自由基清除能力均明顯提高,其中C和C12,Et和Et12的ABTS+·及DPPH自由基清除能力分別相互接近,主要是由于胃蛋白酶的水解作用導致蛋白的水解及多肽的產生,使得大量的疏水氨基酸暴露出來。此外,在酸性條件下胃蛋白酶的水解導致一些結合酚的釋放,增加了自由基清除能力[22]。經過1 h的胰蛋白酶的水解后,不同方式處理的蛋白消化產物的DPPH自由基清除能力降低了32%～62%,主要原因是胰蛋白酶選擇性地切割堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸),消化產物極性增加使得與自由基反應更加困難[23]。

圖3 脫酚及pH偏移處理對CPI體外模擬消化產物ABTS+·(A)和DPPH·(B)清除率的影響

2.2 模擬乳液體外消化

模擬乳液體外消化條件下的微觀結構和粒徑分布如圖4和圖5所示。圖4表明,菜籽蛋白經過pH偏移后,乳化活性及乳化穩定性均有很大提高,因此選擇以pH偏移處理后的蛋白為乳化劑來研究脫酚處理對乳液體外消化性質的影響。采用光學顯微鏡表征乳液在模擬體外消化過程中的微觀結構變化(如圖5)。在胃消化階段所有乳液樣品均處于相對穩定狀態，經過30 min胃蛋白酶水解后,乳液聚集現象明顯,出現乳液分層現象,被水解蛋白進入清液層,上層乳液中的蛋白是由部分水解蛋白和未水解蛋白組成。一方面,在pH2的胃蛋白酶消化過程中,蛋白表面所帶電荷較pH7.5少,斥力減少,從而引起油滴聚集[24];另一方面,胃蛋白酶對油滴表面吸附的蛋白進行了水解,其作用位點是蛋白芳香族氨基酸和一些疏水殘基[24],經過1 h胃蛋白酶消化,蛋白的三級四級結構已被基本破壞,蛋白的乳化能力降低從而誘導油滴聚集[25]。而Et12穩定的乳液液滴聚集程度較C12大,這是由于脫酚后蛋白結構較松散有助于蛋白酶的結合并發生水解,從而誘導乳液部分聚集。胃蛋白酶水解60 min后,乳液液滴變小,且分散較均勻,可能是由于隨著水解時間的延長,大量多肽的形成,蛋白表面帶電量增大,油滴的靜電斥力增強。在小腸消化階段,經過30 min的脂肪酶及胰蛋白酶的水解后,乳液呈現失穩現象,出現明顯的浮油層。從顯微鏡結果觀察,乳液相油滴分散更加均勻。在此階段,由于膽鹽的加入以及脂肪酶水解產生的游離脂肪酸會競爭性地取代油滴表面的蛋白[26],從而形成新的較穩定的乳液。脫酚處理后的蛋白乳液經過1 h的模擬小腸消化,油滴比對照組小。綜合以上現象表明,蛋白經過脫酚處理后能夠提高蛋白乳液的消化率。

圖4 脫酚和pH偏移處理的CPI乳液的乳化活性(EAI)和乳化穩定性(ESI)

圖5 CPI乳液體外模擬消化產物的微觀結構圖

為了進一步驗證乳液在消化過程中的微觀結構變化,對消化過程中乳液平均粒徑進行測定(圖6)。在胃蛋白酶水解30 min后,C12和Et12穩定的乳液平均粒徑明顯增大,分別增大了2.8和3.6倍,表明胃蛋白酶對界面蛋白的水解促進了液滴聚集,尤其是脫酚處理的蛋白乳液。60 min后,乳液粒徑降至2.5～3.5 μm之間。經過1 h的胰蛋白酶及脂肪酶的水解后,C12穩定的乳液粒徑相比在90 min時明顯增大,且大于Et12穩定的乳液平均粒徑,與圖5中的乳液微觀結構趨勢一致。

圖6 脫酚處理對CPI乳液體外模擬消化產物的平均粒徑的影響

3 結論

本實驗針對脫酚處理及pH偏移改性的蛋白,及蛋白穩定的乳液來研究不同體系的體外消化。在模擬蛋白消化過程中,水解度及可溶性蛋白濃度變化的結果表明脫酚處理能顯著提高蛋白的消化率,且脫酚處理結合pH偏移處理可最大程度提高蛋白體外消化率。SDS-PAGE的結果中小分子量條帶的消失也證明了脫酚的效果。pH偏移對蛋白及消化產物的自由基清除能力有明顯提高,并能改善由脫酚導致的較差的自由基清除能力,有望延長蛋白的保質期。乳液消化的研究結果表明,脫酚處理能促進乳液中蛋白的水解并降低油滴尺寸。因此,脫酚結合pH偏移處理可以為菜籽蛋白在人類食品中的應用提供理論指導。