茶多酚的抗癌作用機制及EGCG納米載體技術研究進展

張楊波,饒甜甜,劉仲華,3,*

(1.湖南農業大學教育部茶學重點實驗室,湖南長沙 410128; 2.國家植物功能成分利用工程技術研究中心,湖南長沙 410128;3.湖南省植物功能成分利用協同創新中心,湖南長沙 410128)

茶原產自中國,是一種風靡全球的飲料[1]。根據生產工藝,茶可分為六大類:綠茶、白茶、黃茶、紅茶、烏龍茶和黑茶,加工方式的不同導致不同茶類化學成分存在差異[2]。茶多酚(Tea polyphenol,TP)是茶葉的主要功能成分,是30多種酚類化合物的總稱[3]。最主要的是以兒茶素為代表的黃烷醇類物質,兒茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物,包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)、表沒食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)和表兒茶素(Epicatechin,EC)等主要組分。EGCG是其中生物活性最高的,同時也是含量最多的兒茶素,占兒茶素總量的50%～70%[4]。研究表明,以EGCG為代表的茶多酚類物質具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗肥胖、保護心血管和預防糖尿病等多種保健功效[5]。

腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤,后者就是我們所說的癌癥,癌癥作為全球發病率和死亡率最高的病癥之一,如何預防和治療成為關注的焦點[6]。流行病學研究表明,每天飲茶(≥4杯)可以降低人類患上癌癥的風險[7]。臨床研究表明,經常喝茶能對胃內的惡性腫瘤起到抑制效果,揭示了茶多酚在惡性腫瘤中的輔助治療作用[8]。大量的動物模型實驗也證實了茶及茶多酚對癌癥具有預防和治療的作用[9]。EGCG的體外抗癌活性已被證實,然而因其生物利用度低,在現代治療中的應用有限。在正常生理pH情況下,EGCG的穩定性較低,如何提高其穩定性是 EGCG 作為防癌治癌制品的關鍵之一,有研究表明通過向EGCG中添加生物分子對其穩定性沒有明顯提升效果[10]。相對于傳統材料而言,納米粒子作為一種新型材料,具有卓越的表面效應和尺寸效應,不僅能大幅度提高EGCG的穩定性,還能增加其生物利用率[11]。因此,納米技術作為EGCG的載體成為人們關注的重點。

本文綜述了茶多酚中主要成分EGCG在腫瘤防治中的抗癌機制,包括誘導細胞凋亡、抑制癌細胞轉移和侵染、抑制血管生成、抗甲基化和抵御腫瘤治療中的放射損傷等;為了提高EGCG在生物體中的穩定性與生物利用率,本文對納米載體技術在EGCG中的應用進行了概述,為茶多酚的臨床應用提供依據。

1 EGCG在腫瘤防治方面的機制研究

1.1 EGCG誘導細胞凋亡的作用機理

細胞凋亡是基因控制下的細胞自我消亡的過程,可以通過外部和內部途徑啟動。誘導腫瘤細胞凋亡是目前治療腫瘤的重要研究方向,EGCG的誘導作用主要發生在癌細胞中,使細胞周期停滯于S-G2/M期,對人癌細胞的細胞毒性作用顯著高于對人體正常細胞的作用[12-13]。研究表明在癌癥發展的復雜過程中,持續的能量需求刺激了從頭脂肪生成(DNL)通路的上調,DNL通路新合成的脂肪酸在癌細胞增殖、轉移和抵抗細胞毒性狀態中發揮重要作用,酶抑制靶向DNL通路被認為是治療癌癥的一種替代療法[14]。Khiewkamrop等[15]采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)法測定EGCG對HepG2細胞毒性的影響,其中EGCG處理后,DNL通路中乙酰輔酶A羧化酶(ACC合成酶)和脂肪酸合成酶蛋白(FASN)的表達水平分別下降了42%和51%左右,EGCG對HepG2癌細胞中DNL通路的抑制會降低對癌變有促進作用的肉堿棕櫚酰轉移酶1(CPT-1)的活性,進一步證明,EGCG通過靶向抑制DNL通路中的關鍵酶來觸發細胞凋亡。為了進一步了解其作用機制,Wang等[16]采用細胞計數試劑盒(CCK-8)檢測細胞增殖和細胞毒性,EGCG表現出以劑量和時間依賴的方式誘導生長抑制和凋亡。EGCG在下調B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl2)的同時上調了Fas和Bax的mRNA表達,EGCG通過觸發結構蛋白(Caspase)依賴性內源性(線粒體)和外源性(死亡受體)通路誘導B淋巴瘤細胞凋亡。田夢秋等[17]研究了包括EGCG在內的茶多酚(TP)對人喉癌Hep-2細胞增殖和凋亡的影響，用不同濃度的TP對Hep-2細胞進行處理，結果TP可抑制Hep-2細胞增殖,誘導其凋亡,同時上調了Caspase-3和BaxmRNA的表達,下調了Bcl2 mRNA的表達,呈劑量依賴性。

以上研究表明,茶多酚誘導細胞凋亡的作用機理可能是通過靶向抑制DNL通路中的關鍵酶;調節多種細胞信號通道,例如調節Caspase-3和BaxmRNA表達;抑制Bcl2 mRNA等多種途徑實現。

1.2 EGCG抑制癌細胞轉移和侵染的作用機理

腫瘤轉移是指癌細胞脫離原發部位,侵入淋巴管或血管,在其他組織或器官繼續生長的過程。抑制腫瘤的轉移成為癌癥治療中的關鍵性[18]。黑色素瘤是最常見的皮膚癌和惡性黑色素瘤,TOLL樣受體4(TLR4)在黑色素瘤中起著重要作用。Chen等[19]將黑素瘤細胞株(B16F10和A375)分別用TP和脂多糖(LPS)處理,結果表明TP明顯對體內黑色素瘤(B16F10)的生長起到抑制作用,并呈現劑量依賴性和時間依賴性的特點。在Chen等[20]對EGCG體外治療效果研究中,表明EGCG能夠抑制肝癌細胞的增殖,誘導細胞凋亡,有效抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。此外EGCG處理導致人肝癌細胞中的促血管生長因子基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的下調。Fang等[21]給鼻咽癌異種移植小鼠口服EGCG,發現EGCG實驗組中p53和p21的表達明顯提高,最終通過Caspase 3激活導致鼻咽癌細胞凋亡。以上研究均表明EGCG可以抑制癌細胞的增殖和侵襲,揭示了以EGCG為主要成分的茶多酚可作為安全、有效的抗癌細胞轉移藥物成分。

EGCG抑制癌細胞轉移和侵染的作用機理可能是通過抑制TLR4的表達進而抑制癌細胞功能(增殖、遷移、侵襲),或者通過抑制MMPs或細胞外信號調節激酶的活性來阻止腫瘤細胞的轉移和侵染。

1.3 EGCG抑制血管生成的作用機理

血管生成是指從已有的毛細血管形成新的血管網絡,在腫瘤的轉移過程中起著關鍵性作用[22]。EGCG被證實有顯著的抑制血管生成的作用能有效阻止腫瘤發生轉移[23-24]。Li等[25]采用無血清培養基,培養人NSCLC(A549)細胞24 h,再用不同濃度的EGCG液預處理1 h,然后用胰島素樣生長因子(IGF-I)繼續培養16 h。在體外和體內的實驗中表明EGCG在10、25、50、100 μmol/L可以明顯抑制IGF-I誘導的ECMatrix表面毛細管結構的形成,同時還降低了基質栓中血紅蛋白水平。EGCG能抑制誘導IGF-I下調 HIF-1α蛋白質的表達,當濃度為25和100 μmol/L時有效影響誘導IGF-I VEGF表達,表明EGCG可通過抑制HIF-1α和VEGF表達進而抑制腫瘤血管生成,實現抗腫瘤作用。Jung[26]等通過體內研究法,在人胸腺BALB/c裸鼠皮下注射HT29細胞,并在腫瘤細胞接種后2 d開始每日腹腔注射EC(陰性對照)或EGCG(-1)。與對照組相比,EGCG有效抑制腫瘤生長(58%)、降低微血管密度(30%)、減少腫瘤細胞增殖(27%)、誘導腫瘤細胞凋亡(1.9倍)和內皮細胞凋亡(3倍)。

以上研究說明,EGCG抑制血管生成的作用機理可能是通過阻斷VEGF的誘導來抑制血管生成,從而發揮部分抗癌作用。

1.4 EGCG在表象遺傳修飾中的抗甲基化作用機理

表觀遺傳學是研究基因表達的可遺傳變化,這種變化獨立于原始DNA序列的變化。最近的研究表明,除了基因改變外,表觀遺傳畸變在產生癌癥中起著重要的作用[27]。雖然DNA序列沒有變化,但表觀遺傳變化包括DNA甲基化、組蛋白尾修飾和非編碼RNA的影響。這些修飾主要是通過改變細胞的緊密性和對不同調節蛋白來調節細胞中基因組的正常功能[28]。Berletch等[29]采用EGCG處理乳腺癌細胞(MCF-7細胞),導致hTERT啟動子甲基化和組蛋白H3 Lys9乙酰化的時間依賴性降低,hTERT抑制因子E2F-1在啟動子上的結合增加,這表明EGCG具有表觀遺傳調節的作用。在表觀遺傳修飾中,DNA甲基化是最常見的表觀遺傳修飾[30]。在細胞系研究中,包括EGCG在內的綠茶生物活性物在食管、口腔、皮膚、肺、乳房和前列腺癌細胞的研究中被發現改變了甲基轉移酶(DNMT)的活性[31-33]。Fang等[34]認為EGCG可以抑制DNMT的活性并重新激活腫瘤細胞中甲基沉默基因。EGCG在人類結腸癌、食管癌和前列腺癌細胞中也證實了一些甲基沉默基因的重新激活。在口腔鱗狀細胞癌細胞系中,EGCG也能增加抑癌基因(RECK)的表達。Zhang等[35]也認為EGCG通過對基質金屬蛋白酶抑制劑的去甲基化作用從而在抑制細胞侵襲中發揮關鍵作用。Bag等[36]發現EGCG以劑量依賴性的方式降低了人表皮癌細胞的DNA甲基化水平。EGCG降低了DNMT 1、DNMT 3a和DNMT 3b的表達,還增加了組蛋白乙酰化。此外,EGCG治療導致激活沉默腫瘤抑制基因p16INK4α、p21和Cip1。

EGCG抗甲基化的作用機理主要通過抑制甲基轉移酶的活性和激活某些甲基沉默基因的活性從而達到去甲基化的效果。

1.5 EGCG理療放射性損傷的作用機制

放射治療是治療惡性腫瘤的主要手段之一,在治療過程中易破壞正常組織,如放射性肺損傷、食管損傷、皮膚損傷及造血、免疫功能異常等[37]。近年來大量的動物模型實驗證實,EGCG具有防治放射損傷的作用。You等[38]使用Co輻照器和22戈瑞劑量建立大鼠肺纖維化模型。連續30 d向腹腔注射EGCG(25 mg/kg)或地塞米松(DEX,5 mg/kg),發現EGCG實驗組能夠減少死亡率和肺指數評分,改善肺組織學變化,減少膠原蛋白沉積,降低丙二醛(MDA)含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,抑制(myo)纖維母細胞增生,保護和監管血清水平的TGF-β1、iL-6、iL-10、TNF-α,表明EGCG對于輻照誘導的肺纖維化有顯著的治療效果。Zhu等[39]通過對SD大鼠建立放射性肺損傷的治療模型,EGCG治療明顯降低肺組織肺功能和HYP含量,明顯改善充血水腫,EGCG可能通過強化Nrf2-ARE信號通路和阻斷氧活性,減輕輻射所致大鼠肺炎和肺纖維化,減輕肺組織損傷。在臨床表現中,患者接受乳房切除術后輔助放射治療,放射治療結束后1周內大多數患者出現放射性皮炎癥狀,使用EGCG治療能減輕八成以上的患者疼痛感,灼燒感和瘙癢感[40]。Zhao等[41]開展的Ⅱ期臨床試驗,共組織了37例Ⅲ期肺癌接受放療的患者,診斷為L級放射性食管炎時給予口服EGCG溶液(440 μmol/L,3次/d),結果放療計劃完成后,有8成以上患者放射性食管炎分級降為0級,其他患者也沒有出現惡化。急性放射性食管炎(ARIE)是胸腔放療并發的主要毒性疾病之一,現對 37例IIIA期和IIIB期肺癌患者出現ARIE病癥時,給予口服EGCG治療。每周記錄急性放射反應評價標準評分(RTOG)、放療后第1、2周RTOG評分明顯下降,每周疼痛評分也明顯低于基線[42]。

EGCG治療放射性損傷的作用機理可能是EGCG降低丙二醛(MDA)含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,抑制癌細胞增生;或通過強化Nrf2-ARE信號通路和阻斷氧活性,減輕輻射所致損傷。EGCG為代表的茶多酚類物質可通過外用、注射、口服等多種治療方式對防治放射性治療損傷起到顯著功效,可作為安全有效的惡性腫瘤治療的輔助藥物,EGCG在防治放射性治療損傷臨床應用前景廣闊。

2 EGCG納米載體技術研究

EGCG的體外抗癌活性已被證實,但EGCG在現代治療中的應用有限[43],動物模型表明,EGCG需要一個較高的濃度才能有效的發揮抗癌功效[44]。EGCG化學性質十分活躍,在生理環境中EGCG的穩定性較差,被吸收利用之前易被降解從而不能發揮關鍵性作用[45]。為了提高以EGCG為代表的茶多酚物質生物利用率,納米載體技術成為人們關注的重點[46]。納米技術就是將藥物包埋于納米粒子內部或吸附于納米粒子表面,達到延緩釋放、提高生物活性的目的[47]。EGCG納米顆粒對于人體黑色素瘤細胞的抑制作用比游離的EGCG效果好8倍[48]。不同的納米載體的材料對于EGCG生物利用率的作用有所差別,納米載體成為國內外專家學者研究的重點,主要的材料類型有脂質體、殼聚糖、蛋白質和金屬等。不同材料通過不同方式與EGCG結合,脂質體通常利用多層脂質結構對 EGCG 進行包埋;聚合糖與蛋白質則將EGCG 包埋在高分子結構內部或利用其高分子的結構與EGCG的相互作用使其穩定的吸附在表層;金屬納米則是通過吸附作用將EGCG固定在表層[49]。

2.1 脂質體納米載體

脂質體作為一種納米載體材料,具有雙親性結構,能同時包埋親水性和親油性藥物,具有靶向性、緩釋性、給藥途徑多樣化等優點,但是貯存穩定性欠佳,其水解產物對人體存在一定毒性。Gülseren 等[50]以大豆磷脂和牛奶磷脂為載體,對EGCG進行包埋,探究兩種對載體的穩定性。結構表明,兩種納米載體不僅有利于多酚的釋放,還能表現出較高的生物能效。Liao等[51]也研究了以大豆磷脂、吐溫、乙醇和糖酯制成的復合脂質體,發現這種復合脂質體納米材料能改善透皮性,并且表現出較高的靶向精準性。

2.2 殼聚糖納米載體

目前,已有大量研究表明殼聚糖因其具有良好的生物相容性、微生物降解性強、毒性小的特點,作為EGCG納米載體具有可行性。Zou等[52]發現明膠-殼聚糖作為納米載體,可提高EGCG在空氣中的穩定性,延緩其在口腔中的釋放速度,提高利用率。張茵等[53]通過靜電作用將明膠與殼聚糖結合形成可溶性復合物,制作茶多酚-明膠-殼聚糖(TP-Gel-Cs)納米粒,其載藥量為26.82%,包封率高達90.42%,能減緩EGCG在胃腸道中的降解速度。Liang等[54]將EGCG包埋在葉酸改性羧甲基殼聚糖和殼聚糖鹽酸鹽復合材料中,證明該材料能增強EGCG的緩釋性能,在pH為7.4的PBS緩沖液中,緩釋時間可長達48 h。

2.3 蛋白質納米載體

蛋白質的內部具有多種特殊基團,根據溫度情況可調整空間結構,并能與EGCG以多種形式結合,體現出較好的包埋活性。常見的包埋材料有乳球蛋白、酪蛋白、白蛋白等。以蛋白質為納米載體材料具有生物相容性、可降解性、低毒性、價格低廉等特點。有研究[55-57]發現納米粒的粒徑小,體系的點位非常穩定,包埋率高,能有效控制EGCG的釋放率,提高茶多酚的生物活性。

2.4 金屬納米載體

金屬納米材料自身具有一定生物活性,表面可以引入多種基團,對其進行功能化修飾后對EGCG進行吸附。隨著粒徑的減小,納米粒子的表面原子與總原子數的比值迅速增大,體現出較強的體積效應、表面效應、量子尺寸效應以及宏觀量子隧道效應。Hsieh等[58]將綠茶多酚類物質與金納米材料結合制備載體材料,實驗發現在金納米材料的作用下,多酚類物質的穩定性顯著增強,細胞攝取速度明顯加快,對癌細胞具有選擇毒性,進而實現抗腫瘤的目的。Mukherjee等[59]證實了以巖藻糖-羧甲基殼聚糖與金納米制成的符合材料能顯著提高機體內的抗癌效果。Yuan等[60]發現EGCG與金納米粒子結合能表現出更好的協同效益。

3 總結與展望

本文針對茶多酚中主要成分EGCG在腫瘤防治中的抗癌機制,包括誘導細胞凋亡、抑制癌細胞轉移和侵染、抑制血管生成、抗甲基化和抵御腫瘤治療中的放射損傷等方面的研究進展進行綜述。大量研究表明,茶葉中的茶多酚具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗肥胖、保護心血管和預防糖尿病等多種功效。茶多酚的防癌作用已在多個實驗模型系統中得到證實,在腫瘤發展的起始、促進、轉移和凋亡等多個環節中茶多酚類物質都能起到抑制腫瘤發生的作用。學者們對于茶多酚作為防癌治癌藥物研究進行了大量研究,目前,更應關注以EGCG為主的多酚類物質與其他功能成分,如茶氨酸、咖啡堿等物質拮抗和協同作用,提高EGCG在人體中的利用率。除EGCG外的其他多酚類化合物在生理活性中的研究很少,難以證明其作用機理是否與EGCG相同,需進一步研究其他酚類物質在其輔助抗癌藥物的實驗效果。茶多酚抗癌的研究中臨床效果證據級別不足,同時也缺乏大規模的流行病學的調查研究,臨床應用的拓展有待更多的臨床試驗論證和人群干預研究來做支撐。另外有關茶多酚的抗癌研究中,通常主要集中于功效的研究,對于生物的耐受性、吸收率、抗藥性這方面的研究較少。

為了提高EGCG在生物體中的穩定性與生物利用率,還對納米載體技術在EGCG中的應用進行了概述。以脂質體、殼聚糖、蛋白質、金屬為載體,通過包埋、吸附作用提高EGCG的穩定性和利用率。對于提高茶多酚的生物活利用率,茶多酚的結構修飾是研究的重點。目前,納米載體技術還停留在實驗室階段,需更多的臨床實驗驗證納米材料的可行性,提高茶多酚的穩定性、靶向釋放的精準性以及有效控制其釋放速度,從而提高其生物利用率,為茶多酚的臨床應用、其他類似新藥劑型的開發提供依據。