朝鮮族大醬中異黃酮的提取工藝優化及其抗腫瘤活性研究

齊 欣,張 露,齊仕博,宋鑫萍,崔承弼

(延邊大學農學院,吉林延吉 133000)

朝鮮族大醬是朝鮮族特色食品之一,是由大豆經微生物(如米曲霉、毛霉等)發酵而得的一種發酵制品,因其具有獨特的風味及營養價值[1],被越來越多的大眾接受,近年來對朝鮮族大醬的研究也越來越多。

研究顯示,大豆發酵產品的總酚、異黃酮含量均高于未發酵大豆,且隨著發酵的進行,其中的活性成分也有所變化。朝鮮族大醬中具有多種對人體有益的營養成分[2],其主要功能成分為大豆異黃酮,其具有防治癌癥、抗氧化和改善婦女更年期綜合癥等多種生理功能[3]。據Messina報告,歐美國家患乳腺癌、大腸癌的幾率遠遠高出中國和日本等經常食用豆類食品的國家,據調查統計,在亞洲,每人每天所吸收的大豆異黃酮含量約為40 mg,而美國和歐洲的吸收量則遠遠小于40 mg,僅為3 mg左右[4-5],由此可見,經常食用豆類制品與降低癌癥的發生率有明顯的相關性,攝入足夠的大豆類食物可大大降低女性患乳腺腫瘤疾病的風險[6]。近年來,許多研究人員為了揭示大豆攝取量是否與癌癥的發病率有關,對癌癥發病率進行了調查,調查結果表明患病率極高的幾種癌癥,如:乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及胃癌等疾病的發病率都與豆類食物的攝取量呈現一定的負相關性,由此認為通過攝入大豆異黃酮可以在一定程度上有效地預防和緩解癌癥產生的風險。在有關朝鮮族大醬的研究中,已證明其具有抗突變性[7]。為研究其在乳腺癌細胞增殖方面的作用,對其進行了本次試驗研究。

目前大豆異黃酮的提取方法主要有溶劑萃取法,超聲波萃取法,微波萃取法和超臨界流體萃取法,而溶劑萃取法和超聲波萃取法的使用較為廣泛[8],但仍存在有機溶劑不能高效利用、提取率達不到最佳水平等諸多問題,為能最大程度地利用所選有機溶劑,提高朝鮮族大醬中大豆異黃酮的提取率,本文對超聲波提取異黃酮的工藝進行了優化,并檢測了朝鮮族大醬中異黃酮對乳腺癌細胞的增殖抑制作用以及對凋亡相關蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

朝鮮族大醬 實驗室自制[9];MDA-MB-231、MCF-10A正常乳腺細胞 韓國PSA公司;MCF-7 吉林大學。

無水乙醇 科密歐有限公司;DMEM、胎牛血清 美國Gibco公司;青-鏈霉素、胰酶、PBS 索萊寶公司;總蛋白定量(BCA)測定試劑盒 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;caspase-3抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、β-actin抗體 Abcam(上海)貿易有限公司;CCK-8 碧云天生物有限公司。

HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司;TG16A-WS離心機 上海盧湘儀器有限公司;FA2004分析天平 上海上平儀器有限公司;SP-Max3500FL型多功能熒光酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司;KQ3200DE超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司;EYELA OSB-2100旋轉蒸發儀 日本東京理化有限公司;Micro21低溫超速離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;伯樂電泳儀、伯樂510凝膠成像系統 美國UVP公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 朝鮮族大醬異黃酮的提取工藝 稱取10 g烘干后的大醬粉,加入一定體積乙醇溶液,于一定溫度水浴鍋中保溫浸提一定時間后,以4000 r/min 的轉速離心5 min,取上清液測定大豆異黃酮含量。

1.2.2 單因素實驗 分別考察提取時間、溫度、料液比對朝鮮族大醬異黃酮得率的影響。在溫度為50 ℃、料液比為1∶24時,分別超聲提取40、60、80、100、120 min,研究超聲時間對朝鮮族大醬中異黃酮得率的影響;以料液比為1∶24,30、40、50、60、70 ℃下提取80 min[10],研究提取溫度對朝鮮族大醬中異黃酮得率的影響;在溫度為50 ℃時,料液比分別為1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24超聲提取80 min,研究料液比對朝鮮族大醬中異黃酮得率的影響。

1.2.3 正交試驗 以提取時間、提取溫度、料液比為試驗因素,設計三因素三水平的正交試驗,如表1所示。用體積分數75%的乙醇作溶劑,考核指標為異黃酮得率,進行正交試驗,選出最優組合。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

1.2.4 提取物中異黃酮得率的測定 參考Jia等[11]方法并略有改動。取大醬異黃酮提取液2.0 mL,加40%乙醇3 mL。依次加5% NaNO2溶液0.3 mL、10%硝酸鋁溶液0.3 mL,新試劑加入前都需搖勻并靜置6 min。再加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,用40%乙醇0.4 mL,混合均勻后靜置15 min。在510 nm處測量上述步驟中獲得的混合液的吸光度。以蘆丁為標品作標準曲線,樣品中的異黃酮含量以蘆丁計。異黃酮得率(%)以單位質量大醬粉中提取的異黃酮質量表示,計算公式如公式(1)所示:

式(1)

1.2.5 異黃酮溶液的配制 朝鮮族大醬異黃酮按正交試驗的最優工藝參數進行提取,提取后凍干成粉,并按1.2.4方法測定粉末中異黃酮的質量分數。稱取10 mg提取物粉末,溶于0.1 mL二甲基亞砜(DMSO)中,加入9.9 mL含血清培養基,制得母液濃度為1000 ng/mL,依次稀釋為400、200、100、50、25 ng/mL的藥液,4 ℃保存備用。

1.2.6 CCK-8法檢測朝鮮族大醬提取物對乳腺癌細胞的增殖情況 取對數生長期的MCF-7和MDA-MB-231以及正常乳腺細胞,PBS洗滌三次,加入胰酶進行消化,再加入等體積含血清培養基終止消化,移液槍吹打,轉入15 mL離心管中,1000 r/min離心5 min,離心后棄上清,加入1 mL新鮮培養基重懸,吸取5 μL于細胞計數板中,進行計數,將細胞稀釋成濃度為5×104個/mL的細胞懸液,向96孔板中加入100 μL細胞懸液,相當于每孔接種5000個細胞,放于37 ℃含5% CO2的培養箱中過夜,使細胞貼壁。次日向各孔中加入不同濃度的藥液(25、50、100、200、400 ng/mL)10 μL,于37 ℃含5% CO2培養箱中分別孵育24、48、72 h,孵育后去除培養基,用培養基洗滌細胞兩次,加入100 μL新鮮培養基,各孔再加入10 μL CCK-8,37 ℃孵育,分別在0.5、1、2、4 h測定在450 nm處的OD值。細胞活力計算公式如公式(2):

式(2)

式中:A1-加藥組,細胞、藥物和CCK-8;A2-不加藥組,只加細胞和CCK-8;A0-空白,只加培養基和CCK-8。

1.2.7 異黃酮處理后對乳腺癌細胞凋亡相關蛋白表達量的影響

1.2.7.1 Western Blot試劑準備 10×電泳緩沖液:稱取甘氨酸144.0 g、Tris-base 20.3 g、SDS 10.0 g,用三蒸水定容至1000 mL;10×轉膜緩沖液:稱取甘氨酸144.0 g、Tris-base 30.3 g,用三蒸水定容至1000 mL;20%甲醇:100 mL甲醇于容量瓶中,三蒸水定容至500 mL;1×電泳液:稱取已配好的10×電泳緩沖液50 mL,三蒸水定容至500 mL;1×轉膜液:稱取已配好的10×轉膜緩沖液50 mL,100 mL 20%甲醇,用三蒸水定容至500 mL;TBST:20×TBS 50 mL,1 mL吐溫-20,用三蒸水定容至1000 mL;5%封閉液:稱取脫脂奶粉1 g,用20 mL TBST進行溶解,在搖床上搖勻待用;抗體:參考說明書和預實驗決定稀釋比例,用TBST進行稀釋。

1.2.7.2 Western Blot樣品蛋白提取 取傳代后處于對數生長期的細胞,待鋪滿瓶底70%～80%時加入400、100、25 ng/mL大豆異黃酮提取物,于37 ℃,5% CO2培養箱中培養48 h,取出后用胰酶進行消化,1000 r/min離心5 min,棄上清,每管加入100 μL裂解液吹打,轉移到1.5 mL EP管中,4 ℃、12000×g離心30 min,取上清于1.5 mL EP管中,只取清液,寧少勿多。

1.2.7.3 Western Blot蛋白含量測定 按照賽默飛世爾BCA蛋白含量檢測試劑盒說明進行操作,標準品及樣品于96孔板進酶標儀測定,以標準品濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標做標準曲線,求樣品濃度,按30 μg上樣量計算上樣體積,剩余蛋白以4∶1加入5×蛋白上樣緩沖液放入沸水煮5 min,分裝后放入-20 ℃保存備用。

1.2.7.4 Western Blot電泳 按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒配制12%分離膠以無水乙醇壓平液面,30 min后配制5%濃縮膠插入上樣梳,分離膠和濃縮膠的配制如表2。

表2 分離膠和濃縮膠的配制Table 2 Preparation of separation gel and concentrated gel

待濃縮膠都凝固后,以100 V恒壓,電泳120 min,隨后100 V轉膜60 min,轉膜結束后,將PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉1 h,相應條帶以相應一抗用TBST按比例稀釋后孵育,4 ℃過夜,二抗孵育2 h,用ECL顯色放入凝膠成像系統顯影并拍照。

1.3 統計分析

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 大醬中異黃酮提取率隨提取時間的變化 由圖1可見,提取時間40～80 min時,提取率趨勢為緩慢上升,80～100 min時開始下降,100～120 min緩慢上升。可能由于提取時間過短時,異黃酮并未完全溶到有機溶劑中,但隨著時間的延長,高溫可能導致異黃酮結構受到了破壞,從而提取率下降,因此,提取時間為80 min時朝鮮族大醬中異黃酮提取率最高。

圖1 提取時間對提取率的影響

2.1.2 大醬中異黃酮提取率隨提取溫度的變化 由圖2可見,提取率的整體變化趨勢為隨著溫度的升高,先上升后下降,溫度較高時,可能導致活性物質分解,在溫度為50 ℃時提取率達到最大值0.819%。因此,朝鮮族大醬中異黃酮的最佳提取溫度為50 ℃。

圖2 提取溫度對提取率的影響

2.1.3 大醬中異黃酮提取率隨料液比的變化 如圖3可見,提取率隨著溶劑用量的增多而升高,但料液比達到1∶20后,異黃酮的提取率趨于穩定,說明異黃酮的溶出已達平衡。但料液比為1∶24時的提取率略高于料液比為1∶20時的提取率,考慮到實驗的可操作性以及節約藥品,提取時選擇1∶8、1∶16、1∶24的料液比進行正交試驗。

圖3 料液比對提取率的影響

2.2 正交試驗結果

在單因素實驗的基礎上,按照正交表L9(34)的因素水平組合進行正交試驗,選用體積分數為75%的乙醇作溶劑,考察大醬中異黃酮的提取率,所得結果如表3所示。極差分析表明,對大醬中異黃酮提取率的影響最大的是料液比,其次是提取時間,最后為提取溫度。最佳條件組合是A2B2C3,即提取時間為80 min、料液比為1∶24、溫度50 ℃時提取率最佳,為0.802%。測得蘆丁的標準曲線為y=0.699x+0.036,R2=1,按最優條件提取的凍干后的粉末中總異黃酮含量為(8.00±0.03) mg/g,質量分數為0.8%。

表3 正交實驗設計與結果Table 3 Orthogonal experimental design and results

2.3 CCK-8法檢測朝鮮族大醬提取物對乳腺癌細胞的增殖抑制作用

為探究朝鮮族大醬提取物對乳腺癌細胞增殖的影響,在藥物處理后,通過CCK-8法檢測其對細胞的增殖抑制作用。結果如圖4所示,在24 h時,濃度為400、200、100、50、25 ng/mL的藥物處理后,MDA-MB-231細胞的活力為25.12%、46.67%、60.53%、84.55%、106.97%,MCF-7細胞的活力為18.07%、27.07%、51.54%、68.53%、99.58%,抑制率隨著藥物濃度的增加呈現上升趨勢,兩種細胞活力和抑制率在不同濃度藥物作用下均有顯著性差異(p<0.05),在48 h時,不同濃度的藥物處理后,MDA-MB-231細胞的活力為15.28%、17.29%、42.65%、77.76%、89.03%,MCF-7細胞的活力為15.33%、22.73%、43.73%、62.66%、87.73%,抑制率逐漸上升,在不同濃度藥物作用下,細胞活力及抑制率均有顯著性差異(p<0.05),在72 h時,不同濃度的藥物處理后,MDA-MB-231細胞的活力為14.28%、19.91%、30.23%、33.36%、44.48%,MCF-7的細胞活力為5.41%、13.58%、25.05%、32.97%、44.38%,抑制率呈上升趨勢,兩種細胞隨著藥物濃度的遞增,細胞活力和抑制率均有顯著性差異(p<0.05)。而正常乳腺細胞MCF-10A中,除400 ng/mL處理72 h外，不同濃度藥物作用均無顯著性差異(p>0.05),且細胞活力在藥物作用24、48 h后均在90%以上,在作用72 h后細胞活力均在80%以上,已知細胞活力在90%以上為無細胞毒性,細胞活力在80%～90%為亞毒性,可見朝鮮族大醬提取物在作用24、48 h時各濃度對正常乳腺細胞無毒性,根據以上數據確定后續試驗中使用的高、中、低劑量濃度分別為400、100、25 ng/mL,作用時間選定48 h,通過以上數據可以看出,隨著藥物濃度的增加,細胞活力越來越低,抑制率越來越高,隨著作用時間的延長,抑制率顯示出增加的趨勢,由此可見朝鮮族大醬提取物以劑量和時間依賴性的方式抑制乳腺癌細胞增殖。

2.4 藥物處理后對乳腺癌細胞凋亡相關蛋白表達量的影響

圖5(A)朝鮮族大醬異黃酮為MCF-7和MDA-MB-231兩種乳腺癌細胞經低、中、高濃度藥物處理48 h后Western Blot檢測凋亡相關蛋白的表達情況,圖5中(B)、(C)為經ImageJ分析的條帶量化圖,結果顯示,藥物處理組中促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表達量與空白對照組相比均顯著上升(p<0.05),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯下降,且呈現劑量依賴性。

圖5 藥物處理后乳腺癌細胞中凋亡相關蛋白表達量的變化

3 討論

目前國內外對異黃酮的提取方法主要有以下幾種,溶劑萃取法[12]、微波輔助萃取法[13-15]、超聲輔助提取法[16-19]、超臨界流體萃取法[20]以及高壓浸提法[21]和連續逆流法[22-23]。超聲波提取與傳統工藝加熱回流提取相比,具有省時、節約溶劑、提取率高的優點,在謝明杰等[24]人的研究中,通過對加熱回流和超聲波法的比較發現,超聲波提取方法明顯優于加熱回流法,利用超聲提取30 min所得大豆異黃酮的得率為0.452%,加熱回流提取120 min的得率為0.310%,加熱回流提取2次合計提取240 min的大豆異黃酮得率為0.451%。本實驗中通過單因素和正交試驗,對超聲波提取朝鮮族大醬中的大豆異黃酮進行了提取優化,最終異黃酮得率為0.802%,進一步提高了其提取率,使原料和溶劑能夠達到充分的利用。

現有研究已表明異黃酮具有抗癌的功效,其對肺癌、乳腺癌、肝癌等均能起到抑制腫瘤細胞生長,促進其凋亡的作用。有學者[25]研究了6328個病例中患有乳腺癌的幾率,從統計結果中發現常常從食物中攝取大豆異黃酮的人患有乳腺癌的幾率與不攝取或偶爾攝取的人相比有明顯的差異,不攝取或偶爾攝取大豆異黃酮的人患病的幾率遠遠高于經常攝食的人,這就說明了大豆異黃酮能夠有效地降低惡性乳腺腫瘤的患病幾率。胡建偉等[26]人研究了大豆異黃酮對大鼠乳腺癌發病率的影響,結果顯示大豆異黃酮能夠顯著地降低乳腺癌發病率。這與本試驗中大豆異黃酮能夠抑制乳腺癌細胞增殖的結果相吻合。韋立群等[27]人的研究指出染料木素對細胞的抑制率呈現一定的劑量和時間依賴性,在染料木素作用后,能夠呈濃度依賴性上調Bax、Caspase-3蛋白的表達,下調Bcl-2蛋白的表達,本實驗當中,cck-8法檢測后發現朝鮮族大醬異黃酮能夠抑制乳腺癌細胞的增殖,對正常乳腺細胞無毒副作用,Bax和caspase-3的表達量在其作用后均有提升,Bcl-2的表達量有所下降,這與韋立群等人的研究結果一致,可見朝鮮族大醬異黃酮在對乳腺癌細胞的增殖和凋亡上起到了一定的作用。

4 結論

通過單因素實驗和正交試驗得出,對大醬中異黃酮提取率的影響最大的是料液比,其次是提取時間,最后為提取溫度。最佳提取條件為:提取時間80 min、料液比1∶24、溫度50 ℃,此時得率為0.802%。通過CCK-8實驗可看出,朝鮮族大醬異黃酮對正常乳腺細胞無毒副作用,對MCF-7和MDA-MB-231兩種乳腺癌細胞有抑制作用,且有劑量依賴性。經朝鮮族大醬異黃酮處理后的兩種乳腺癌細胞當中,與凋亡相關蛋白的表達量均有所變化,其中促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達量隨著藥物劑量的增加而升高,而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達量則隨著藥物劑量的增加而降低,由此可見,朝鮮族大醬中的異黃酮可以在一定程度上抑制乳腺癌細胞的增殖,并影響凋亡相關蛋白的表達,其對乳腺癌細胞的生長能夠起到抑制作用。