響應面法優化蘋果多酚微膠囊工藝

石靜文,馬春麗,梁佳祺,邵伯悅,亓藝潔

(東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

蘋果多酚是蘋果中所含多元酚類的總稱,包含有黃酮醇、原花青素、表兒茶素等成分,具有很強的抗氧化性[1-2]。蘋果多酚可以提高人體的免疫力,預防衰老以及輔助治療心血管疾病、炎癥[3],還可以用作水果飲料和果汁中的澄清劑[4]。但蘋果多酚在潮濕、陽光、高溫等不利條件下極易氧化[5],失去活性,這些不利因素限制了蘋果多酚的應用。研究表明:微膠囊是一種能夠為微生物、酶、生物活性物質提供保護,使其免受不良環境破壞的有效方法之一[6-7]。大量研究表明蘋果多酚安全無毒,對人體沒有任何毒副作用[8]。

目前關于微膠囊化的常見方法包括:噴霧干燥、乳化法、擠壓法等[9-10]。其中擠壓法多采用生物活性物質與親水性的壁材相混合,通過噴嘴,滴加到反應進程中,是一種簡單、高效、成本低廉的方法[11],擠壓法在制作多酚類微膠囊的時候由于反應條件溫和,能夠最大程度地保存多酚的生物活性,且形成的微膠囊在模擬胃液和模擬腸液中都表現出相對較高的穩定性[12]。梁旭等[13]使用殼聚糖和玉米淀粉包埋蘋果多酚,但是未對包埋后的蘋果多酚微膠囊進行胃腸道中的緩釋實驗。

本試驗采用擠壓法制備蘋果多酚微膠囊并對微膠囊的制備條件進行優化,旨在較低成本的條件下提高蘋果多酚的包埋率,為蘋果多酚抵抗不良環境提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果多酚(食品級,含量≥75%) 上海源葉生物技術有限公司;海藻酸鈉 天津市光復精細化工研究所;氯化鈣 華美生物工程公司;殼聚糖、福林酚 Biotopped公司;沒食子酸、磷酸氫二鉀、鹽酸 天津市科密歐化學試劑開發中心;碳酸鈉 天津市東麗區天大化學試劑廠;乙醇 天津市天力化學試劑有限公司;胃蛋白酶(3000 IU/g) Oxoid公司;胰蛋白酶(4000 IU/g) Amresco公司；其他試劑 均為國產分析純。

GL-12B型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;精密pH計 北京朋利馳科技有限公司;PL403型電子天平 Mettler Toledo(上海)有限公司;UV-2401PC型紫外分光光度計 北京京科瑞達科技有限公司;DL-360A型超聲清洗器 上海之信儀器有限公司;FD-5型真空冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠;磁力攪拌器 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微膠囊制備 本試驗采用擠壓法制備微膠囊[14]。按芯壁比取海藻酸鈉溶液與多酚溶液混合,42 ℃水浴攪拌30 min;再取一定量的殼聚糖溶液與氯化鈣溶液混合,調整pH,定容至50 mL;將配制好的殼聚糖與氯化鈣混合液置于燒杯中,取海藻酸鈉與多酚混合液,緩慢滴于燒杯中,低速攪拌20 min,靜置20 min,過濾分離,收集濾液,經冷凍干燥得微膠囊制品。

1.2.2 單因素試驗 采用1.2.1的方法對蘋果多酚進行包埋,包埋條件為:氯化鈣濃度0.040 g/mL、pH7.0、芯壁比2∶1,研究海藻酸鈉濃度(0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 g/mL)對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響;海藻酸鈉濃度0.020 g/mL、pH7.0、芯壁比2∶1,研究氯化鈣濃度(0.020、0.030、0.040、0.050、0.060 g/mL)對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響;海藻酸鈉濃度0.020 g/mL、氯化鈣濃度0.040 g/mL、芯壁比2∶1,研究pH(6.2、6.6、7.0、7.4、7.8)對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響;海藻酸鈉濃度0.020 g/mL、氯化鈣濃度0.040 g/mL、pH7.0,研究芯壁比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響。

1.2.3 響應面優化試驗 在單因素試驗的基礎上,根據響應面Box-Benhnken試驗設計原理,選取海藻酸鈉濃度(A)、氯化鈣濃度(B)、pH(C)、芯壁比(D)四個因素,以微膠囊包埋率為響應值,設計四因素三水平的響應面優化試驗,確定蘋果多酚微膠囊包埋的最佳工藝(表1)。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Levels and code of independent variable used for response surface analysis

1.2.4 微膠囊包埋率測定 采用Folin-Ciocalteu測定蘋果多酚含量[15],按照沒食子酸當量法測定蘋果多酚含量,繪制沒食子酸標準曲線為Y=7.23208X-0.00417,R2=0.9994,線性范圍在0～100 μg/mL。根據1.2.4.3公式計算出各工藝條件下蘋果多酚的微膠囊包埋率,并對結果進行比較分析。

1.2.4.1 微膠囊表面蘋果多酚含量測定 稱取1.0 g微膠囊成品,定容在100 mL容量瓶中,混勻10 min,用移液管取1 mL上清液定容在25 mL容量瓶中,10 min后在760 nm處測定吸光值,利用標準曲線計算微膠囊表面蘋果多酚的含量。

1.2.4.2 微膠囊內部蘋果多酚含量測定 稱取1.0 g微膠囊樣品,用30 mL無水乙醇溶液溶解壁材,超聲清洗30 min,取1 mL溶解液,定容在25 mL容量瓶中,10 min后在760 nm處測定吸光值,利用標準曲線計算微膠囊內部蘋果多酚含量[16]。

1.2.4.3 微膠囊包埋率計算

式(1)

式中:m1為微膠囊表面蘋果多酚的含量,mg;m2為微膠囊內蘋果多酚的含量,mg。

1.2.5 微膠囊在人工胃液和腸液中穩定性的測定 模擬人工胃液[17]:鹽酸溶液16.4 mL,胃蛋白酶10 g,加去離子水攪拌均勻后,定容至100 mL,此時pH約為2,備用。

模擬人工腸液:稱取磷酸二氫鉀6.8 g,胰蛋白酶10 g,加去離子水使之溶解,定容至1 L,用氫氧化鈉調節pH=6.8備用。

取0.5 g微膠囊分別加入裝有100 mL人工胃液、人工腸液的三角瓶中,于37 ℃搖床中振蕩處理0.5、1、1.5、2、2.5 h;分別取樣,測定蘋果多酚含量,并計算微膠囊緩釋率[18]。

微膠囊緩釋率計算公式:

微膠囊緩釋率(%)=釋放的蘋果多酚含量(mg)/包埋的蘋果多酚含量(mg)×100

式(2)

1.2.6 數據統計分析 每個試驗重復3次,采用Design Expert 8.0.6軟件對中心組合試驗設計進行相關性和差異顯著性統計分析,并采用Origin 8.5進行作圖,并進行多元統計學分析。

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉濃度對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

海藻酸鈉濃度對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響見圖1。

圖1 海藻酸鈉濃度對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

由圖1可知蘋果多酚微膠囊的包埋率隨著海藻酸鈉濃度的增加而顯著升高(p<0.05),當海藻酸鈉濃度達到0.020 g/mL時,微膠囊包埋率達到最大,為82.44%,海藻酸鈉濃度繼續增加,微膠囊包埋率反而逐漸下降,這可能是因為當海藻酸鈉濃度過低時,溶液粘度較小,形成的微膠囊壁材較薄,導致包埋率降低;當海藻酸鈉濃度過大時,海藻酸鈉的粘度也隨之增大,蘋果多酚溶液沒有與壁材均勻混合以及形成的微膠囊壁較厚,導致蘋果多酚微膠囊的包埋率降低[19-20]。

2.2 氯化鈣濃度對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

氯化鈣濃度對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響見圖2。

圖2 氯化鈣濃度對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

由圖2可知蘋果多酚微膠囊的包埋率隨著氯化鈣濃度的增加而顯著增加(p<0.05),當氯化鈣濃度到達0.040 g/mL時,微膠囊包埋率達到最大值,隨著氯化鈣濃度的繼續增加,包埋率逐漸降低。溶液中Ca2+濃度過低時,不利于海藻酸鹽沉淀的形成,降低蘋果多酚微膠囊包埋率;Ca2+濃度逐漸增大,增加了Ca2+與海藻酸鈉之間的凝膠化反應[21],有利于微膠囊的形成,包埋率也隨之增大;Ca2+濃度過大時,溶液中大量的Ca2+增加了微膠囊的表面張力,海藻酸鈉無法再與氯化鈣進行凝膠反應,導致微膠囊的包埋率逐漸下降[22]。

2.3 pH對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

pH對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響見圖3。

圖3 pH對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

由圖3可知pH<6.2時,微膠囊無法形成,pH>7.8時,微膠囊相互粘連,成囊效果差,成囊后粒徑變大,考慮蘋果多酚在過酸過堿的環境下自身結構會遭到破壞,影響微膠囊的包埋率,蘋果多酚微膠囊的包埋率在pH=7時達到最大。因此在6.2

2.4 芯壁比對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

芯壁比對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響見圖4。

圖4 芯壁比對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響

由圖4可以看出蘋果多酚微膠囊的包埋率隨著芯壁比的增加逐漸增大,當芯壁比為2∶1時,蘋果多酚微膠囊的包埋率最大。芯壁比過高和過低造成微膠囊成囊不均、無法成囊,且包埋率也受到影響。芯壁比超過2∶1時,包埋率顯著降低(p<0.05)。

2.5 響應面試驗

2.5.1 模型的建立及顯著性檢驗 根據響應面Box-Benhnken試驗設計,以包埋率為響應值,選擇海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、pH、芯壁比四個因素進行29組試驗,響應面分析方案及試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及結果Table 2 Experimental scheme and results of response surface method

采用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的數據進行多元線性擬合,可得出蘋果多酚包埋率(%)與各因素編碼值之間的多元二次回歸模型:Y=85.30+0.19A+0.36B+0.18C+0.015D-1.15AB+0.92AC-0.47AD-2.09BC-0.17BD+0.62CD-6.12A2-5.44B2-4.97C2-4.92D2。

對模型方程進行顯著性檢驗,見表3。

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance test of regression equation and variance analysis(ANOVA)

由表3可知,模型中全部二次項對響應值Y(包埋率)的影響都極顯著(p<0.01);一次項中A、C、D對響應值Y影響顯著(p<0.05),B對響應值Y影響極顯著(p<0.01);交互項除BD外對Y的影響全都極顯著(p<0.01),BD對Y的影響不顯著(p>0.05)。由此可知,各實驗因素對響應值的影響具有交互作用,并非是單純的線性關系。

2.5.2 各因素交互作用的響應曲面和等高線圖分析 通過Design Expert 8.0.6軟件對回歸方程進行擬合,得各因素間交互作用的響應曲面圖和等高線,見圖5。響應曲面中各因素對應曲線的陡峭程度與其響應值影響程度呈正相關。

響應面中的等高線圖、曲線圖都反映了兩個不同條件相互交互作用對蘋果多酚微膠囊包埋率的影響,曲線圖反映的更為直觀,研究表明,等高線的形狀越接近圓形,表明兩個因素相互交互作用越弱,越接近橢圓形相互交互作用越強,影響越顯著[11,23]。

圖5中等高線圖形接近橢圓形,表明兩個變量的交互作用對蘋果多酚微膠囊包埋率有顯著影響。其中(1)和(4)的等高線圖為橢圓形,這也體現了兩種壁材濃度的交互作用對微膠囊包埋率的影響顯著,當一種壁材濃度不變時,微膠囊的包埋率隨另一種壁材濃度的增加而增加,隨后逐漸平緩。壁材與pH之間的交互作用也對微膠囊包埋率的影響顯著,當壁材濃度不變時,微膠囊包埋率隨pH升高而增大隨后不變;當pH不變時,微膠囊的包埋率隨壁材濃度的增加而增加,隨后平緩[24]。

2.5.3 最優條件的確定及驗證 通過軟件分析得出的使用海藻酸鈉和殼聚糖包埋蘋果多酚的最佳工藝參數為:海藻酸鈉濃度為0.020 g/mL,氯化鈣濃度為0.040 g/mL,pH為7.01,芯壁比為2.02∶1,此時蘋果多酚的微膠囊包埋率為85.31%。為了實際操作中的便捷,將最佳工藝參數調整為:海藻酸鈉濃度為0.020 g/mL,氯化鈣濃度為0.040 g/mL,pH為7.0,芯壁比為2∶1。在此條件下進行三次平行試驗,測得蘋果多酚的包埋率為85.13%,與預測值相對誤差為0.21%,結果穩定,預測值可信。因此采用響應面Box-Benhnken試驗優化得到的蘋果多酚微膠囊的工藝條件準確可靠,具有實用價值。

2.6 優化后的微膠囊模擬胃腸道測定

優化后蘋果多酚微膠囊在模擬胃腸液中釋放曲線如圖6。

圖6 優化后蘋果多酚微膠囊體外釋放曲線

由圖6可知微膠囊在模擬胃液中,壁材受胃液影響,逐漸被破壞,釋放蘋果多酚,在1.5 h時達到最大釋放量,為73.18%。在0～1.5 h內微膠囊釋放率逐漸增加,說明蘋果多酚含量逐漸增多,1.5 h后蘋果多酚的濃度趨于穩定(p>0.05)。微膠囊在模擬腸道中,1 h時蘋果多酚的釋放量達到最大,1 h后蘋果多酚的濃度趨于穩定,最大釋放率為83.00%(p>0.05),并且從圖6中可以明顯看出,微膠囊在模擬腸液中的釋放時間小于模擬胃液,釋放率大于模擬胃液,這是由于在pH>5.5的環境中,Ca2+與磷酸根的結合能力比海藻酸鈉的結合能力要強[25],對微膠囊的破壞大于模擬胃液,且在胃液環境中,Ca2+的交聯作用要大于腸液。

3 結論

在單因素基礎上,利用響應面的方法進行分析,得出的制備蘋果多酚微膠囊的最佳工藝條件:海藻酸鈉濃度為0.020 g/mL,氯化鈣濃度為0.040 g/mL,pH為7.0,芯壁比為2∶1。在此條件下,獲得的蘋果多酚的包埋率為85.13%。此條件下微膠囊成囊率高,在模擬胃液和模擬腸液中緩釋效果良好,腸液中的最大釋放率為83.00%。該方法簡便可行,是一種制備蘋果多酚微膠囊的有效方法,并且微膠囊產品在模擬胃腸液中有良好的釋放能力。微膠囊化的蘋果多酚改善了多酚不穩定易被破壞的缺點,并且增加蘋果多酚的緩釋特性,為蘋果多酚的廣泛應用提供了一種新的途徑。