超臨界流體技術制備肉桂醛/殼聚糖膜抑菌包裝材料

唐 川,楊 銘,盧 軒

(大連大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116622)

隨著人們對食品質量及其安全要求的提高,只起到簡單隔絕作用的傳統食品包裝已不能滿足人們的需求。具有抑菌、抗氧化等功能的包裝材料逐漸受到關注,這些活性包裝材料通常采用“基質材料+活性物質”的策略[1-3]。基質材料多為生物相容性及生物可降解性聚合物,如聚乳酸(PLA)、聚羥基脂肪酸酯(PHA)、聚己內酯(PCL)等人工合成高分子材料及目前研究更為廣泛的淀粉類、纖維素類、殼聚糖類等天然高分子材料;活性物質多采用具有抑菌、抗氧化作用的丁香酚、香芹酚、百里香酚、肉桂醛等天然植物提取物[4-6]。殼聚糖(chitosan,CS)是甲殼素經脫乙酰得到的產物,來源廣泛價格低廉,具有良好的生物相容性和生物可降解性,且成膜性好、可食用,作為基質材料在食品領域研究廣泛[7-9]。肉桂醛(cinnamaldehyde,CI)是一種天然醛類化合物,廣泛存在于肉桂等植物內,具有較強的抑菌作用,是良好的天然抑菌劑[10]。將肉桂醛負載于基質材料中是制備抑菌材料的一種有效策略[11-13]。

目前,將活性物質負載于基質材料中的方法主要有溶液浸漬法和直接混入法。這些方法在處理過程中會使用大量有機溶劑或需要在較高溫度下操作,易導致活性物質失活、分布不均勻和產品有機溶劑殘留等問題。超臨界溶液浸漬法(supercritical solution impregnation,SSI)是一種將小分子物質通過超臨界二氧化碳(SC-CO2)負載到基質材料中的技術[14]。SSI操作條件溫和,對環境友好,不改變基質材料結構,且活性物質負載量可通過調節過程參數進行調節,在食品工業中具有極大應用潛力。但目前SSI在食品包裝中的研究較少,國內還未見報導,并且國外的研究多集中于合成高分子包裝材料中活性物質的負載,天然高分子包裝材料中活性物質的負載研究較少,相關研究亟待開展[15-16]。

本研究擬通過SSI過程將肉桂醛負載至殼聚糖膜(chitosan film,CSF)中,制備得到CI-CSF抑菌包裝材料。對CI-CSF的肉桂醛負載量、形貌、水蒸氣透過率、結晶性、不透明度以及抑菌性能進行考察,探索SSI過程制備食品活性包裝的應用潛力,為SSI過程制備食品活性包裝的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖(CS,脫乙酰度85.0%,黏度154 mPa·s) 濟南海得貝海洋生物工程有限公司;肉桂醛(CI,純度>95.0%) 生工生物工程(上海)股份有限公司;CO2(食品級,純度>99.9%) 大連永豐氣體有限公司;冰醋酸、甘油(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphlycoccusaureus) 大連大學生命科學與技術學院。

SFE-500MR-2-FMC10 SSI裝置 美國Waters公司;S-4800型掃描電子顯微鏡 日本日立公司;Magna-550Ⅱ型紅外光譜儀 美國尼高力公司;X’Pert RPD型X射線衍射儀 荷蘭PANalvital公司;DNP-9162型恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;DZF-6021型真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖膜的制備 殼聚糖基質膜采用溶液澆注法制備,制備方法如下:將殼聚糖原料溶解于1% V/V醋酸水溶液中,形成4% W/V的殼聚糖溶液,并向殼聚糖溶液中加入甘油作為塑化劑至1% V/V;取殼聚糖溶液50 mL倒入100 mm×100 mm的Teflon方皿中,45 ℃下干燥過夜,脫模后即得殼聚糖膜。得到的殼聚糖膜密封保存于干燥皿中備用。

1.2.2 SSI過程負載肉桂醛 采用SSI過程制備負載肉桂醛殼聚糖膜(CI-CSF),SSI過程設備如圖1所示。SSI流程參照本課題組之前的研究[17]:殼聚糖膜包裹于濾紙中置于高壓釜攪拌槳上部,肉桂醛加入至高壓釜底部,不與殼聚糖膜直接接觸,肉桂醛加入量可保證高壓釜內超臨界二氧化碳(SC-CO2)達到飽和;CO2經冷卻槽冷卻至0 ℃,通過高壓泵送入高壓釜中,高壓釜中壓力和溫度分別由高壓泵及加熱夾套控制,待壓力和溫度達到設定值后,浸漬2 h;實驗結束后,關閉高壓泵,打開泄壓閥,以一定速率進行泄壓;最終取出樣品置于密封袋中,保存于干燥皿中,等待進一步的表征。本研究考察浸漬溫度40 ℃,浸漬時間2 h條件下,浸漬壓力(10、15 MPa)及泄壓速度(1、5 MPa/min)對肉桂醛在殼聚糖膜中的負載量的影響。

圖1 SSI過程示意圖

1.2.3 CI-CSF形貌的表征 CI-CSF的形貌采用掃描電子顯微鏡進行表征。將CI-CSF樣品裁剪成適宜大小片狀,通過碳膠帶固定于樣品臺上,CI-CSF截面樣品采用剪刀進行切割后通過碳膠帶固定于樣品臺上,樣品在真空環境下,噴金處理20 s后,加速電壓5.0 kV下,進行掃描電子顯微鏡表征,觀察其形貌。采用螺旋測微儀對CI-CSF膜厚進行測量,在CI-CSF上任意取5點進行厚度測量,結果取平均值。

1.2.4 CI-CSF負載量的測定 CI-CSF中肉桂醛負載量采用分光光度法測定[18]。取50 mg的CI-CSF浸于10 mL乙醇中,超聲功率600 W下處理30 min,使負載的肉桂醛全部溶解于乙醇中。隨后樣品溶液經0.45 μm微孔濾膜過濾后濾液于290 nm處測定吸光值,根據標準曲線(A=0.06428C+0.01814,A為吸光值,C為肉桂醛濃度,單位mg/L,R2=0.9991)計算得到負載的肉桂醛質量。CI-CSF負載量(loading capacity,LC)定義為負載的CI質量與CSF質量之比。

1.2.5 CI-CSF水蒸氣透過率(WVP)的測定 CI-CSF水蒸氣透過率按照ASTME96-90標準測定[19]。選用直徑40 mm的透濕杯,內裝3 g無水氯化鈣,用CI-CSF將透濕杯口覆蓋并密封固定,稱重后置于干燥器中。干燥器中盛有飽和氯化鈉溶液保持相對濕度75%,并置于30 ℃培養箱中。每12 h稱量一次,記錄透濕杯質量的增加量,根據式1計算水蒸氣透過率:

式(1)

式中,ΔW/Δt為單位時間內增加的水的質量(g/s);l為CI-CSF厚度(m);A為有效的擴散面積(m2);ΔP為CI-CSF兩側的水蒸氣滲透壓差(Pa)。

1.2.6 CI-CSF不透明度的測定 CI-CSF不透明度按照文獻中方法進行測定[6]。將樣品膜裁剪成4 cm×1 cm大小,貼在比色皿一側,采用可見分光光度計以空白比色皿為參比于600 nm處測定其吸光度,不透明度(Opacity)由式2計算:

式(2)

式中,A600為600 nm處樣品吸光度;l為樣品厚度(mm)。

1.2.7 CI-CSF結晶性的測定 CI-CSF結晶性通過X射線衍射儀進行表征,工作電壓40 kV,管電流40 mA,Cu靶,Ni過濾片Kα發射,掃描范圍5～60 °,掃描速度5 °/min。

1.2.8 CI-CSF抑菌性的測定 通過抑菌圈法對CI-CSF的抑菌性能進行考察[17]。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別在Luria-Bertani(LB)培養基中37 ℃下培養8 h進行活化,活化后在Tryptic Soy Agar(TSA)平板上培養得到單菌落。挑取單菌落接種于5 mL LB培養基中,37 ℃下搖床培養8 h。將菌液稀釋10 倍,取200 μL涂布于TSA平板,然后將直徑為10 mm的CI-CSF置于平板上,于37 ℃下培養24 h,測量CI-CSF抑菌圈大小。同時取空白CSF作為陰性對照。

1.3 數據處理

本文中所有實驗均平行三次或三次以上。數據均以平均值(mean)±標準差(SD)表示。數據圖采用Origin 7.5軟件完成。

2 結果與分析

2.1 CI-CSF負載量

CI-CSF中肉桂醛負載量結果如表1所示,CI-CSF中肉桂醛的負載量在1.64%～2.44%范圍內,浸漬壓力15 MPa,泄壓速度1 MPa/min時負載量最大,為2.44%。由結果可見,在同一壓力下,泄壓速度為1 MPa/min時,CI-CSF負載量大于泄壓速度為5 MPa/min時的CI-CSF負載量。這是由于在較低泄壓速度下,肉桂醛從SC-CO2中析出負載于殼聚糖膜中;在較高的泄壓速度下,溶解有肉桂醛的SC-CO2更加傾向于離開殼聚糖膜,最終導致肉桂醛的負載量降低。并且在較高浸漬壓力下,這種現象更加明顯,這可能是由于在較高壓力時,肉桂醛在SC-CO2中的溶解度也更大[20],泄壓時隨SC-CO2擴散出殼聚糖膜的肉桂醛也更多。從結果中還可以看出,在相同的泄壓速度下,CI-CSF的負載量隨壓力變化不明顯,這說明SSI過程中泄壓速度對肉桂醛在CI-CSF中負載量影響更大。

表1 CI-CSF負載量、厚度、水蒸氣透過率、不透明度結果Table 1 LC,thickness,WVP and opacity of CI-CSF results

2.2 CI-CSF形貌

SSI過程前后殼聚糖膜形貌如圖2所示。圖2中(a)、(b)為溶液澆注法制備得到殼聚糖膜表面及截面圖,(c)、(d)為SSI過程(15 MPa、1 MPa/min)制備得到的CI-CSF樣品表面及截面圖。由結果可見,CSF表面平整光滑,經過SSI過程負載肉桂醛后,CI-CSF表面較平整,但出現鱗狀結構,這可能是由于肉桂醛負載至CSF中,使殼聚糖分子鏈之間產生間隙,并且SSI過程泄壓時壓力的變化使殼聚糖表面產生輕微剝離現象,因此表面產生鱗狀結構。但由圖2(b)、(d)截面圖可見,SSI過程前后CSF截面并未出現明顯變化,這可能是由于殼聚糖分子鏈之間的間隙較小,難以在SEM圖片中觀察到。截面SEM圖片中出現擠壓及變形現象,這是由于CSF及CI-CSF截面樣品制備時,采用剪刀進行切割導致的,SSI過程前后CSF和CI-CSF截面形貌并未發生明顯變化。由圖2(c)可見,CI-CSF樣品表面無明顯肉桂醛附著,結合CI-CSF負載量結果可知,SSI過程肉桂醛的負載并不是簡單地析出附著在殼聚糖膜表面,而是由SC-CO2將肉桂醛溶解后,擴散進入殼聚糖膜中,泄壓后均勻析出分散于殼聚糖膜中,這一結果也與之前的研究結果相符[21]。

圖2 CSF及CI-CSF掃描電鏡圖

2.3 CI-CSF水蒸氣透過率及不透明度

CI-CSF水蒸氣透過率結果如表1所示。采用SSI過程負載肉桂醛制備得到的CI-CSF與空白CSF相比,水蒸氣透過率明顯升高。雖然肉桂醛的疏水性質可能會導致CI-CSF的水蒸氣透過率降低,但是結合CI-CSF的SEM結果可知,CI-CSF表面SEM圖片中可觀察到輕微剝離現象,這可能是由于肉桂醛在CI-CSF中的負載使得殼聚糖分子間產生間隙,并且SC-CO2在泄壓過程中使得CSF中產生微小的空隙,但這種空隙較小,未在CI-CSF截面SEM圖片種直接觀察到,在這些因素共同作用下,使得CI-CSF的水蒸氣透過率增大[22],同時也使得CI-CSF的不透明度顯著增加。

2.4 CI-CSF X射線衍射譜圖

SSI過程浸漬前后CSF和CI-CSF的XRD譜圖如圖3所示。由圖3中(a)可知,CSF衍射角在20 °附近出現衍射峰,說明殼聚糖具有晶體結構。SSI過程負載肉桂醛后,CI-CSF在10 °附近出現較弱的衍射峰,且衍射峰較寬,說明晶粒尺寸較小,這一現象也與文獻中的結果相似[23]。

圖3 CSF及CI-CSF的X射線衍射譜圖

2.5 CI-CSF抑菌性能

肉桂醛可破壞細菌的細胞膜,影響細胞的正常生長,進而抑制細菌的繁殖[24]。采用SSI過程制備的負載肉桂醛的CI-CSF,其抑菌性能對其應用具有重要意義。本研究采用抑菌圈法考察了CI-CSF對兩種常見食源性細菌的生長抑制情況,結果如表2所示。CI-CSF對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用,且對金黃色葡萄球菌抑制作用強于大腸桿菌。并且由表2可見,隨著CI-CSF中肉桂醛負載量的增加,對細菌生長的抑制作用增強,這是由于肉桂醛對細菌的生長抑制作用具有濃度依賴性,因此負載量大的CI-CSF具有更好的抑菌性能。空白CSF未展示出對供試菌的生長抑制作用,說明CI-CSF對供試菌的生長抑制作用源于其中負載的肉桂醛。

表2 CI-CSF對供試菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of inhibition cycle of CI-CSF on two bacterias

3 結論與討論

本研究以CSF為基質,肉桂醛為抑菌物質,通過SSI過程將肉桂醛負載至CSF中制備CI-CSF用于抑菌包裝材料。通過調節SSI過程參數,可對CI-CSF中肉桂醛負載量進行調節,泄壓速度對肉桂醛在CI-CSF中負載量影響較大,浸漬壓力15 MPa、泄壓速度1 MPa/min條件下,CI-CSF中肉桂醛的負載量最高為2.44%。SSI過程后CI-CSF表面較平整,水蒸氣透過率和不透明度較空白CSF均有升高。CI-CSF對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有抑制作用。采用SSI方法將肉桂醛負載于CSF中制備CI-CSF,過程條件溫和且避免了有機溶劑的使用,所得CI-CSF具有良好的抑菌效果,在食品活性包裝領域具有應用潛力。