金銀花醇提物對水溶性紅曲色素的護(hù)色作用研究

邱華振,楊昳津,胡 健,王光強(qiáng),熊智強(qiáng),張 匯,艾連中,夏永軍,*

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海食品微生物工程技術(shù)研究中心,上海 200093;2.上海金楓酒業(yè)股份有限公司,上海 200120)

福建紅曲米產(chǎn)品全國出名,具有成熟的生產(chǎn)工藝和典型的代表性[1]。紅曲色素作為食品添加劑應(yīng)用于酒類、飲料以及熟食等食品中[2]。然而紅曲色素光不穩(wěn)定特性制約了紅曲色素廣泛的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)紅曲色素褪色主要機(jī)制是光降解[3],在光照條件下紅曲色素吸收光子后被激化,由于光的吸收、自由基的產(chǎn)生、發(fā)色團(tuán)的破壞,導(dǎo)致變色和褪色[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的金銀花 山東臨沂沂蒙山;水溶性紅曲紅色素、水溶性紅曲黃色素 山東中惠生物科技股份有限公司;維生素C、蘆丁、槲皮素、醋酸銨 分析純,上海源葉生物科技有限公司;綠原酸 分析純,上海生工生物工程股份有限公司;冰醋酸 分析純,上海泰坦科技股份有限公司;三乙胺、鹽酸 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈(分析純)、400度富爾馬肼(Formazine)濁度標(biāo)準(zhǔn)液 上海安譜實驗科技股份有限公司。

IKA研磨機(jī) IKA集團(tuán)有限公司;PB-10普及型pH計 德國Sartorius公司;2468-2414型液相色譜儀 Waters公司;SpectraMax i3x酶標(biāo)儀 Molecular Devices;HWS-26型水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV2600型紫外分光光度計 尤尼柯儀器有限公司;RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;KQ-600B型超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金銀花醇提物的制備 準(zhǔn)確稱取制備好的金銀花粉末2.0 g于100 mL的容量瓶中加入60 mL 55%的乙醇進(jìn)行超聲提取,超聲時間為30 min、溫度60 ℃[11]。趁熱過濾,濾渣采用相同的方法進(jìn)行浸提,重復(fù)2次。將所有過濾后的濾液合并,于圓底燒瓶中55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,然后進(jìn)行真空干燥制得金銀花醇提物干粉,于干燥皿中4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紅曲色素水溶液及金銀花醇提物色素溶液的制備 分別稱取紅色素和黃色素0.1 g溶于1000 mL的去離子水中,配制成紅色素水溶液和黃色素水溶液,取100 mL上述色素溶液分別添加0.05 g金銀花醇提物,配制成0.5 mg/mL金銀花醇提物色素水溶液,充分溶解并4 ℃遮光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 紅曲色素溶液及添加金銀花醇提物色素溶液的紫外吸收波長掃描 將配制好的水溶性紅曲紅色素(下文稱“紅色素”)溶液和水溶性紅曲黃色素(下文稱“黃色素”)溶液以及分別添加金銀花醇提物的色素溶液用紫外-可見光分光光度計進(jìn)行250～550 nm全波長掃描,確定其最大吸收峰的吸光值(Amax),以及添加金銀花醇提物后是否影響其最大吸收峰。

1.2.4 紅曲色素溶液的紫外降解動力學(xué)分析 本實驗通過紫外照射加快色素光降解,控制紫外光源距離來控制紫外強(qiáng)度[12]。準(zhǔn)確量取50 mL紅色素和黃色素溶液分別置于四個Φ=8 cm透紫外石英平皿中,依次距離40 W、250 nm紫外燈光源4、8、12、16 cm下進(jìn)行紫外照射實驗[13]。每隔15 min取一次樣,用分光光度計測定其Amax并計算色素保存率。

1.2.5 金銀花醇提物添加量的確定 分別用紅色素、黃色素水溶液配成0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL的金銀花醇提物溶液,分別取50 mL置于Φ=8 cm透紫外石英平皿中進(jìn)行紫外照射每隔30 min取樣一次,分光光度計測定其Amax并計算其色素保存率;同時測定不同濃度下的金銀花醇提物色素水溶液的濁度(NTU),觀察其添加量對色素水溶液濁度的影響。

1.2.6 酸性條件下金銀花醇提物對色素光穩(wěn)定性的影響 分別取100 mL兩種色素水溶液用1 mol/L鹽酸調(diào)成pH4、pH7,各取50 mL配成濃度為0.5 mg/mL金銀花醇提物色素水溶液,以不添加金銀花醇提物的色素溶液為空白對照組,然后進(jìn)行紫外照射每隔30 min取樣一次,測其Amax并計算色素保存率。

1.2.7 金銀花醇提物HPLC分析

1.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的制備 精密的稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品綠原酸3.95 mg、蘆丁4.90 mg、槲皮素2.12 mg于25.00 mL的容量瓶中,甲醇溶解,搖勻,定容制成0.158 mg/mL綠原酸、0.196 mg/mL蘆丁、0.085 mg/mL槲皮素的混合對照品溶液。分別取1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL至10 mL的容量瓶中,甲醇溶解并搖勻,定容。用0.25 μm微孔濾膜過濾,得到一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合液。準(zhǔn)確稱取實驗室制得的金銀花醇提物粉末0.003 g,甲醇溶解,搖勻,定容于25 mL容量瓶中,充分溶解,用0.22 μm微孔濾膜過濾,得到供試品溶液。

1.2.7.2 色譜條件 色譜柱為Sepax HP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱;流動相:乙腈(A);0.01 mol/L醋酸銨溶液(每100 mL中0.2 mL三乙胺,乙酸調(diào)pH至4.8)(B),采用梯度洗脫,梯度洗脫程序:0～30 min,A∶B 8∶92～30∶70 (V/V),流速:1.00 mL/min,檢測波長350 nm[14]。

1.2.7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在上述的條件下對上述的樣品進(jìn)行HPLC檢測分析,以綠原酸、蘆丁、槲皮素測定峰面積值(y)為縱坐標(biāo);以其相應(yīng)的一系列濃度(x)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計算回歸方程:綠原酸:y=12258x-92.325,R2=0.9999;槲皮素:y=34736x-94.721,R2=0.9999;蘆丁:y=16565x-44.851,R2=1.0000。

1.2.8 綠原酸對紅曲色素的護(hù)色效果分析 各取0.05 g綠原酸、金銀花醇提物、VC,分別用紅色素水溶液和黃色素水溶液配制成0.5 mg/mL綠原酸色素溶液、0.5 mg/mL金銀花醇提物色素溶液、0.5 mg/mL VC色素溶液,分別取50 mL置于Φ=8 cm透紫外石英平皿中距離紫外燈16 cm進(jìn)行照射,每隔30 min取樣一次測其Amax并計算其色素保存率。

1.2.9 色素保存率的計算 以A(%)對時間作圖來表示紅曲色素隨光降解濃度隨時間的變化關(guān)系,并按下式來計算色素保存率。

保存率:A(%)=Ax/A0×100

式中:A0為色素的起始Amax值;Ax為處理后色素Amax值。

1.2.10 紅曲色素水溶液濁度的測定 運用WGZ-1A散射光濁度儀對紅曲色素水溶液濁度進(jìn)行測定。分別將零度水和富爾馬肼倒入樣品瓶中,液體凹液面與其刻度線齊平,然后擰緊瓶蓋并擦拭干凈瓶上的指印和水跡,然后置入樣品座內(nèi)蓋上遮光蓋,分別進(jìn)行調(diào)零和校準(zhǔn)。調(diào)零校準(zhǔn)后同樣方法對樣品進(jìn)行濁度測試,待數(shù)值穩(wěn)定后即可記下紅曲色素溶液的濁度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、方程擬合和方差分析,采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素溶液以及添加金銀花醇提物色素溶液的紫外吸收波長掃描圖分析

圖1中a紅色素在486 nm處有最大吸收峰,與文獻(xiàn)中所測最大吸收峰一樣[15]。圖c黃色素在466 nm處有最大吸收峰,與文獻(xiàn)中的最大吸收峰相近[16]。圖b、d與原始紅曲色素溶液相比,添加了金銀花醇提物后的色素溶液吸收特征在可見光部分沒有顯著變化,即金銀花醇提物對紅曲色素的吸收峰沒有影響,根據(jù)Fuleki所做實驗的結(jié)論,在沒有其他介質(zhì)干擾的情況下可以用最大吸收峰的吸光度值(Amax)來表示色素的含量[17]。

圖1 水溶性紅曲色素溶液吸收特征分析

2.2 兩種水溶性色素紫外光降解動力學(xué)分析

由圖2a可知,紅色色素保存率與紫外照射時間負(fù)相關(guān),距離紫外光源的距離越近下降速率越快[18]。在距離紫外光源16、12、8、4 cm條件下,每隔15 min取樣一次并測其色素保存率。照射105 min后,色素保存率分別由100%下降到43.09%、34.98%、19.65%、8.90%;由圖2b可知,黃色色素保存率由100%下降到36.95%、22.17%、12.77%、6.33%。隨著紫外強(qiáng)度的增加和照射時間的延長,紅色素和黃色素開始降解,顏色不斷的變淺。由于隨著紫外強(qiáng)度的增加和照射時間的延長，水溶液中發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生大量的羥基自由基(·OH)等氧化離子,導(dǎo)致色素的光氧化降解[7]。由色素的光化學(xué)反應(yīng)機(jī)理可知,色素光降解的反應(yīng)速率公式為:dA/dt=-kA0,積分后為ln(A/A0)=-kt即A(%)=e-kt[19],式中A表示色素一定時間t照射后的色素含量,A0表示初始色素含量,A(%)表示色素保存率。表1中色素保存率和紫外照射時間(t)的回歸方程可以看出,回歸系數(shù)R2都大于0.9800,因此色素光降解過程中色素保存率A(%)與時間t符合一級動力學(xué)方程。

圖2 不同光照強(qiáng)度條件下色素保存率與照射時間的關(guān)系

表1 色素降解動力學(xué)方程分析Table 1 Analysis of the degradation kinetics of pigments

2.3 金銀花醇提物添加量的確定

由圖3a可知,隨著金銀花醇提物濃度的增加,紅色素保存率下降速度緩慢。在相同條件下照射180 min后,不同金銀花醇提物濃度0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL色素保存率分別由100%減少到20.43%、42.80%、53.59%、55.27%、57.92%、60.72%。由圖3b可知,隨著金銀花醇提物濃度的增加,黃色色素保存率下降速度緩慢。相同條件下照射180 min后,色素保存率分別由100%下降到19.12%、34.18%、42.22%、44.25%、46.53%、51.60%。可以看出隨著金銀花醇提物濃度的增加黃色色素保存率也不斷的增加。但從0.5 mg/mL開始紅色素和黃色素增長趨勢均變緩慢。由圖3c可知,隨著金銀花醇提物添加濃度的增加紅色素水溶液的初始濁度開始增加,分別為2.13、11.87、15.00、17.57、21.40、22.60 NTU;由圖3d可知,隨著金銀花醇提物添加濃度的增加黃色素水溶液的初始濁度也開始增加,分別為1.10、6.10、8.13、9.77、11.03、14.53 NTU。綜合濁度、成本以及效果考慮我們選擇金銀花醇提物濃度為0.5 mg/mL為最佳添加濃度。

圖3 金銀花醇提物添加量對色素濁度的影響

2.4 酸性環(huán)境下金銀花醇提物對色素光穩(wěn)定性的影響

我國市場大部分飲料呈酸性,其pH在2.5～7.5之間[20]。水溶性紅曲色素作為天然色素廣泛地被應(yīng)用到酒水、飲料當(dāng)中。溶液過酸過堿都會使色素褪色降解[21],水溶性紅曲色素在酸性飲料中的使用受到了限制[22]。由圖4a可知,相同條件下照射180 min紅色素水溶液在pH7、4條件下,空白組色素殘存率分別由100%下降到了20.43%、11.95%;添加金銀花醇提物色素殘存率分別由100%下降到了56.26%、54.72%,色素保存率分別是空白組的2.75倍、4.58倍,因此金銀花醇提物在酸性條件下有效地提高了紅色素光穩(wěn)定性。由圖b可知,相同條件下照射180 min黃色素溶液在pH7、4條件下,空白組色素保存率分別由100%下降到了19.12%、8.07%;添加金銀花醇提物色素殘存率分別由100%下降到了52.58%、47.85%,色素保存率分別是空白組的1.75、5.93倍,因此金銀花醇提物有效地提高了色素的酸穩(wěn)定性。

圖4 不同pH條件下金銀花醇提物對色素光穩(wěn)定性的影響

2.5 金銀花醇提物護(hù)色部分有效物質(zhì)的分析

研究表明金銀花中含有很多抗氧化物質(zhì),如綠原酸、槲皮素、蘆丁、木犀草素等,其中含量最多的是綠原酸[14],本文采用高效液相色譜法對其有效物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測。由圖5a可知,通過對綠原酸、蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析,保留時間分別為7.19、20.30、34.08 min。由圖5b可知,金銀花醇提物溶液主要含有綠原酸和槲皮素不含蘆丁。由綠原酸回歸方程y=12258x-92.325,槲皮素回歸方程y=34736x-94.721計算,可得出金銀花醇提物中綠原酸和槲皮素的含量分別為108.13、25.19 mg/g。

圖5 綠原酸、蘆丁、槲皮素和金銀花醇提物的HPLC分析圖

2.6 金銀花醇提物和綠原酸的護(hù)色作用效果

通過圖6中的a、b可以看出,金銀花醇提物和綠原酸以及VC對紅色素和黃色素的光穩(wěn)定性都有較好的作用。對于紅色素在相同條件下照射180 min,對照組、0.5 mg/mL VC色素溶液、0.5 mg/mL金銀花醇提物色素溶液、0.5 mg/mL綠原酸色素溶液色素保存率分別由100%降到27.20%、55.05%、59.37%、49.44%。可以看出金銀花醇提物的護(hù)色效果最佳,其次是VC和綠原酸，色素保存率分別是空白對照組色素保存率的2.18、2.02、1.82倍。所以金銀花醇提物和綠原酸都具有良好的護(hù)色效果。對于黃色素相同條件下照射180 min,對照組、0.5 mg/mL VC色素溶液、0.5 mg/mL金銀花醇提物色素溶液、0.5 mg/mL綠原酸色素溶液其色素保存率分別由100%降到13.79%、48.14%、44.06%、35.34%。可以看出對于黃色素護(hù)色效果最好的是VC,其次是金銀花醇提物和綠原酸,分別是對照組色素保存率的3.49、3.20、2.56倍。因此金銀花醇提物對水溶性紅曲色素就有很好的護(hù)色效果,通過綠原酸的護(hù)色作用可以看出,金銀花醇提物的護(hù)色作用可能與綠原酸的存在密切相關(guān)。

圖6 金銀花醇提物護(hù)色效果及有效物質(zhì)分析

3 結(jié)論

水溶性紅曲紅色素和水溶性紅曲黃色素都會發(fā)生光降解反應(yīng),且光照強(qiáng)度越強(qiáng)降解速率越快,符合一級降解動力學(xué)方程。結(jié)合添加金銀花醇提物后色素溶液的濁度(NTU),確定金銀花醇提物最優(yōu)添加量為0.5 mg/mL,紫外照射180 min紅色色素保存率可以達(dá)到56.26%(空白組20.43%);黃色色素保存率可以達(dá)到52.58%(空白組19.12%)。在pH=4的條件下,紅色素和黃色素添加金銀花醇提物的色素保存率分別是空白組的4.58、5.93倍。因此金銀花醇提物能有效提高水溶性紅曲紅色素、黃色素的保存率以及酸性條件下的光穩(wěn)定性。通過HPLC分析,金銀花醇提物中含有大量的綠原酸,紅色素以及黃色素溶液中分別添加0.5 mg/mL綠原酸,色素保存率分別是空白組的2.18、3.20倍,因此金銀花醇提物的護(hù)色作用與其所含綠原酸密切相關(guān)。金銀花醇提物作為純天然的紅曲色素護(hù)色劑,其成本低,天然無害,具有很好的應(yīng)用前景。