基于氫化物原子熒光光譜法分析富硒釀酒葡萄與釀造產物中的硒

鄭 宇,侯彤瑤,王宗義,*,李德美,李虎軍,張竹琴,張亞東

(1.北京農學院,食品科學與工程學院,食品質量安全北京實驗室,農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京北農葡萄酒工程技術中心,北京 102206;2.北京拓普威釀酒科技有限公司,北京 102413)

硒是一種具有抗氧化[1]、拮抗重金屬[2]和抗癌[3]等多種生理功效的微量元素,硒缺乏[4-5]或過量[6]均會致病。最新調查顯示,我國31%～69%的居民硒攝入量不足[7]。富硒食品是提高我國居民硒攝入量的一個重要途徑。食品中硒可大體分為有機硒和無機硒,前者如硒蛋白、硒代氨基酸,后者如硒酸鈉、亞硒酸鈉,其中有機硒毒性低,且有更好的吸收率和利用率[8-9]。因此,硒相關檢測方法的建立,對評價富硒食品的營養價值和質量安全,指導相關產品的開發具有重要意義。

目前,食品中硒的檢測方法主要有氫化物發生-原子熒光光譜法(HG-AFS)、熒光分光光度法(FS)[10]、石墨爐原子吸收光譜法(GF-AAS)[11]、氣相色譜法(GC)[12]和電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[10,13-14],其中FS、GC法需要進行衍生,GF-AAS易在石墨爐灰化階段造成硒損失而影響檢測結果[15],應用報道較多的是HG-AFS和ICP-MS。無機硒、有機硒等形態分析,則需要高效液相色譜(HPLC)與HG-AFS、ICP-MS等進行聯用解決[16-17],成本較高。對樣品進行提取[18-19],HG-AFS測定無機硒,再通過總硒扣除無機硒來計算有機硒的方法較為簡單,成本低,但提取液中的硒代氨基酸等有機硒能使無機硒的檢出結果偏高,降低結果的可靠性。本文針對釀酒葡萄樣品,擬通過優化消解還原條件和無機硒的提取分離方法,建立總硒、無機硒的檢測方法,提高總硒測定的穩定性,克服硒代氨基酸對無機硒測定的干擾,并對施用富硒葉面肥的釀酒葡萄與釀造產物進行了追蹤檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三個品種的施硒肥釀酒葡萄、對照釀酒葡萄、酒渣、酒泥和成品葡萄酒 由北京拓普威葡萄酒公司采樣提供,于冰箱中冷凍儲存。其中美樂葡萄樣品6個,對照樣3個,水分含量為72.90%;品麗珠葡萄樣品4個,對照樣2個,水分含量74.48%;霞多麗葡萄樣品1個,對照樣品1個,水分含量為75.00%。各葡萄樣品分別來自酒莊不同地塊,花期前2次、坐果和轉色期各3次施用富硒葉面肥,并于葡萄成熟期采摘;富硒葉面肥 主要成分為硒氨基酸螯合物(含有少量無機硒),安丘鑫海生物肥料有限公司;酒渣、酒泥、成品葡萄酒 來自施硒肥的美樂釀酒葡萄,其中酒渣采自酒精發酵后期,酒泥采自乳酸、蘋果酸發酵后期,成品葡萄酒窖藏兩個月,酒精度為14%。NaOH、NaBH4、HClO4、HNO3、HCOOH和鹽酸 優級純,國藥集團化學試劑有限公司;GSB 04-1751-2004硒標準溶液(無機硒) 1000 μg/mL,國家有色金屬及電子材料分析檢測中心;GBW10046(GSB-24)河南小麥成分分析標準物質:硒含量為60±10 μg/kg 地球物理地球化學勘察研究所IGGE。

Cleanert PCX-SPE固相萃取柱(60 mg,3 mL) 天津博納艾杰爾科技有限公司;AFS-9130 雙道原子熒光光度計(配有AS-30自動進樣系統) 北京吉天儀器有限公司;EHD 36消解爐(配有φ30 mm容積75 mL磨口玻璃帶塞消解管) 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄樣品的預處理 取500 g鮮葡萄于電熱鼓風干燥箱中60 ℃烘干48～72 h至干燥恒重,同時計算初始水分含量,然后將樣品粉碎,過40目篩,于玻璃封口樣品瓶中4 ℃冰箱保存。

1.2.2 總硒測定的樣品處理 稱取干燥的葡萄試樣0.5 g,解凍后的酒渣、酒泥試樣1.0 g,精確至0.0001 g,于消解管中,加入HNO3-HClO4體積比為4∶1的混合酸10 mL,浸泡過夜(8～12 h),于消解儀上180 ℃帶蓋(有放氣孔)消解至溶液無色(或清亮)透明,開蓋趕酸,待冒白煙后,繼續加熱至溶液約為2 mL左右,取出冷卻至室溫,往消解管中加入3 mL 6 mol/L的鹽酸,消解儀上100 ℃加熱處理20 min,取出冷卻,用純水定容至10 mL容量瓶中待測。葡萄酒樣品稱樣量為10 g,精確至0.001 g,加入混酸10 mL后,140 ℃處理2 h,升溫至180 ℃進行消解,其他操作同上。

1.2.3 無機硒測定的樣品處理 取0.5 g烘干的葡萄樣品于50 mL離心管中,準確加水20 mL,常溫下振蕩浸提1 h后,10000 r/min離心10 min,上清液經玻璃棉過濾,用甲酸調節pH1～2后,取10 mL完全通過PCX固相萃取柱(3 mL甲醇,3 mL水活化),并收集于消解管中,按1.2.2葡萄酒的消解方法進行消解與還原。

1.2.4 無機硒提取溶液的選擇與分離效果的驗證

1.2.4.1 無機硒提取溶液的選擇 取0.5 g釀酒葡萄樣品添加40 μg/kg無機硒,按1.2.3的提取方法分別使用6 mol/L HCl(A)、0.1 mol/L HCl(B)、純水(C)、0.5%(V/V)NH3·H2O(D)、0.5%(V/V)NH3·H2O-1 mol/L NH4H2PO4(39+1)(E)5種溶液進行提取,離心后,再按1.2.2葡萄酒消解方法進行消解還原,上機檢測,通過W(提取率,%)=m(檢測值)/M(實際添加值)×100,計算提取率。

1.2.4.2 無機硒分離效果驗證 對0.5 g釀酒葡萄樣品進行以下處理,分析熒光值變化。A.樣品全消解(同1.2.2處理);B. 經20 mL超純水提取1 h,10000 r/min離心10 min,取10 mL用甲酸調節pH后,過已活化的PCX柱,收集于消解管中進行消解(同1.2.3處理);C.同B提取,離心后取10 mL直接消解;D.添加40 μg/kg無機硒,同B提取,離心后取10 mL調節pH過柱消解;E. 同D添加,同B提取,離心后取10 mL直接消解;F. 添加40 μg/kg無機硒,80 μg/kg硒代氨基酸(硒代蛋氨酸與胱氨酸的混合物),同B提取,離心后取10 mL調節pH過柱消解;G.同F添加,同B提取,離心后取10 mL直接消解。

1.2.5 原子熒光分析

1.2.5.1 分析條件 載流溶液:5%(V/V)的鹽酸;還原溶液:含1%(M/V)NaBH4、0.5%(M/V)NaOH的溶液;載氣(Ar)流量:250 mL/min;屏蔽氣(Ar)流量:800 mL/min;燈電流:120 mA;輔陰極電流:60 mA;負高壓:300 V;原子化器高度:8 mm;進樣體積1.0 mL。

1.2.5.2 定量檢測 對濃度為0.25、0.5、1.0、2.0和4.00 μg/L的系列標準溶液(儀器自動用載流液稀釋)和樣品溶液、試劑空白溶液等上機檢測,以熒光值對濃度做標準曲線,對樣品溶液進行定量。對熒光值超出校準曲線范圍的試樣,將樣液用載流液稀釋后重新進行測定。

1.3 數據處理

使用Afs-9x系列原子熒光光度計工作站軟件和Microsoft Excel 2007進行相關數據處理和t檢驗等統計分析。

2 結果與討論

2.1 樣品消解與還原條件的優化

預實驗表明,按國標法推薦的樣品量(0.5～3 g)和HNO3-HClO4用量(9+1,10 mL),釀酒葡萄樣品不能消解完全,溶液渾濁且有較深顏色,需再補加混酸1～2次。茍體忠等[20]的研究顯示當HNO3-HClO4體積比為2∶1時,植物樣品的消解效果較佳,但后續趕酸時間過長。本實驗,調整HNO3-HClO4體積比為4∶1,用量10 mL,樣品消解徹底,溶液清亮,由于HNO3的相對用量減少,待趕酸至冒白煙時,恰約剩余2 mL,用時較短,較為適宜。進一步考察了消解溫度,當設定溫度低于170 ℃時消解速度過慢,高于190 ℃不易控制消解液體積,故本實驗采用消解溫度為180 ℃。此外,本實驗在消解過程中于消解管上加蓋(帶有放氣孔),混酸消解管內的回流,減少了消解液的蒸發損失。消解完成后,加入過量的鹽酸,將六價硒還原為四價硒。

如圖1所示,還原溫度是影響測定結果穩定性的重要因素,當還原溫度小于120 ℃時,測定熒光值平穩,當溫度大于120 ℃,特別是將樣液加熱至再次冒白煙時,測定熒光值降低,這可能是硒元素形成硒揮發物損失所致[20],故本實驗選擇還原溫度100 ℃;進一步對5～40 min還原時間進行考察,熒光值保持平穩,結果如圖2所示,說明還原時間5～40 min 不影響檢測結果,本實驗使用還原時間為20 min。

圖1 還原溫度對硒元素熒光值的影響

圖2 還原時間對硒元素熒光值的影響

2.2 無機硒提取溶液的選擇與分離效果的驗證

2.2.1 無機硒提取溶液的選擇 文獻報道提取無機硒的溶劑有酸溶液[21]、水[22]和堿溶液[23];本文對5種提取溶劑的提取效果進行比較,計算提取率,結果見圖3。提取液A、B效果較差;C、D和E的提取率均達80%以上,說明純水和堿性溶液有更好的提取效果,再加入磷酸鹽后,提取率進一步提高,這可能由于磷酸根離子參與樣品基質對硒酸根、亞硒酸根離子的吸附競爭所致。本研究為更有利于后續離子交換對無機硒進行分離,選用純水做提取溶劑。

圖3 不同提取溶液提取效率的影響

2.2.2 無機硒分離效果驗證 實驗發現,葡萄樣品的各類提取液均不能直接用于HG-AFS檢測無機硒,需要進一步消解還原處理,這會使提取液中可能存在的硒代氨基酸等轉化為無機硒,對測定結果產生干擾,因此,需要進一步凈化去除。本實驗將提取液酸化后,流經聚合物型強陽離子交換小柱,使游離硒代氨基酸和一些弱極性化合物被吸附,而陰離子形態的無機硒則不被保留,直接收集到消解管中。

為進一步驗證無機硒的分離效果,實驗設計了7組處理(1.2.4.2),各組熒光值t檢驗(p<0.01)對比情況如圖4所示。結果顯示,D、F的熒光值,與E-C的熒光值(E與C的熒光值之差),無顯著差別,而G組熒光值顯著高于D、E和F處理的熒光值(p<0.01),表明提取液中的無機硒在小柱上無保留,而硒代氨基酸被有效截留;A處理熒光值顯著高于B、C處理熒光值(p<0.01),而B、C熒光值接近試劑空白值,表明葡萄試樣中的結合態硒不能被提取,D、E、F的熒光值顯著高于B、C(p<0.01),說明無機硒能被有效提取。

圖4 不同處理檢測熒光值的比較

2.3 方法線性關系、檢出限、定量限、準確度和精密度

經對硒濃度0.25～4 μg/L系列溶液進行驗證,呈現良好線性關系,標準曲線為:y=187c-15.2(y為熒光值,c為溶液中硒濃度),R2=0.9989。由于空白釀酒葡萄試樣不易獲得,故選擇低硒含量的釀酒葡萄(未施硒肥)和添加了5 μg/kg無機硒的低含量釀酒葡萄,分別按總硒和無機硒的處理方法,進行10次分析,計算熒光值標準差,按不小于3倍和10倍熒光值標準差,計算檢出限和定量限(總硒、無機硒基本一致),釀酒葡萄試樣(干樣)分別可達2和5 μg/kg。同樣方法,葡萄酒試樣可達0.2和0.5 μg/kg。

準確度和精密度評價通過測定硒標準質控樣和加標回收試驗完成。硒標準質控樣測定值與標準值符合良好,見表1,表明應用改進的消解還原條件對檢測結果無影響。取烘干未施硒肥的葡萄樣品進行低、中硒水平添加,施硒肥的葡萄樣品高硒水平添加,每個水平重復6次,按本實驗確定的方法進行消解還原后,進行測定,進一步評價總硒測定的準確性和精密度,結果亦見表1,回收率為 96.47%～97.39%,相對標準差為1.76%～5.65%。說明改進消解還原條件后,檢測的準確度和精密度保持良好。由于酒渣、酒泥和葡萄酒都來源于葡萄,因此未對此三種基質中的總硒加標回收率進行考察。

表1 釀酒葡萄中總硒測定的準確性和精密度(n=6)Table 1 Accuracy and precision for determination of total selenium(n=6)

注：ND小于方法檢出限。取烘干施硒肥的葡萄樣品,進行3水平6重復的加標回收實驗,評價無機硒檢測的準確性和精密度。結果見表2,回收率為85.20%～88.91%,相對標準差為5.97%～21.45%,其中相對標準差較總硒相對較高,仍然有較好的準確性和重復性。由于葡萄試樣中未檢出無機硒,本實驗未對酒渣、酒泥和葡萄酒的無機硒檢測方法進一步研究和方法學考察。

表2 釀酒葡萄中無機硒測定的準確性和精密度(n=6)Table 2 Accuracy and precision for determination of inorganic selenium(n=6)

2.4 施用富硒葉面肥后釀酒葡萄樣品及其釀造物中硒含量的追蹤檢測

應用本法,對釀酒葡萄試樣進行了檢測,結果硒肥組和對照組的釀酒葡萄均未檢出無機硒(未列出),但硒肥組和對照組的總硒含量存在極顯著差異(p<0.01),硒肥組的總硒含量為9.65～38.6 μg/kg(鮮樣),約高出對照組3倍,達到富硒食品的標準[24],說明施用富硒葉面肥可以有效提高葡萄果實中硒含量,且為有機硒。由于硒肥中的硒主要是硒的螯合物,所以果實中的有機硒形態還有待進一步分析。

表3 釀酒葡萄中的總硒含量(μg/kg)Table 3 Total selenium content in wine grapes(μg/kg)

對硒肥組美樂釀酒葡萄釀造后的酒渣、酒泥和葡萄酒進行追蹤檢測,總硒含量亦存在極顯著差異(p<0.01),酒渣、酒泥和葡萄酒中總硒含量和存留分數見表4,其中硒存留分數按75%的出酒率計算(酒渣20%,酒泥5%)。可見酒渣中硒含量最高,是鮮樣硒肥組美樂釀酒葡萄平均硒含量的近6倍,其硒存留率為89.3%,說明葡萄酒釀造過程中硒主要沉積在酒渣中,再隨酒泥沉降一部分,僅有2.0%存留在葡萄酒中。

表4 釀造產物中的硒含量Table 4 Selenium content in wine grapes and their brewed products

3 結論

本文以釀酒葡萄為材料,通過優化消解還原條件和無機硒提取方法,建立了原子熒光光譜法檢測總硒和無機硒的檢測方法。方法學性能表現良好,在考察的濃度范圍內(0.25～4 μg/L),R2大于0.99,總硒回收率和標準偏差分別為 96.47%～97.39%和1.76%～5.65%,無機硒回收率和標準偏差分別為85.20%～88.91%和5.97%～21.45%,無機硒測定時能夠有效克服硒代氨基酸干擾,為富硒釀酒葡萄產品的開發和質量評價提供了有效檢測手段。對施用富硒葉面肥的釀酒葡萄與釀造產物的追蹤檢測顯示,富硒葉面肥可以有效提高葡萄果實中有機硒含量,達到富硒食品的硒含量標準,但其形態還有待進一步研究;葡萄酒的釀造過程中,硒主要隨酒渣、酒泥流失,葡萄酒中的留存率較低。