聚球藻PCC7002營養特性分析

郭 偉,高風正,馮一農,楊益盛,郭騰蛟,馮廣鑫,吳浩浩,曾名湧

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

微藻營養豐富,蛋白質含量高,具有多種功能性成分,作為一種“超級食品”在食品中被廣泛應用[1]。目前,我國的微藻類新食品原料有螺旋藻、蛋白核小球藻、雨生紅球藻、鹽藻及提取物、DHA藻油、裸藻和葛仙米等[2],僅占35萬種微藻資源的極小部分,豐富的微藻資源尚待開發。聚球藻PCC7002(Synechococcussp.PCC7002,以下稱“聚球藻”)是一種單細胞海洋藍藻,直徑在0.5～2.0 μm之間。它們分布廣泛,數量巨大,在海洋初級生產力中占據重要位置[3]。聚球藻分裂速度快,對數期倍增時間小于2 h[4],環境適應能力強,兼具廣鹽性和廣溫性,可以以自養、異樣和混合營養等不同方式進行生長,有希望成為生產優質蛋白和其他營養素的良好來源。

由于聚球藻具有自然轉化能力,基因背景清楚,多年來被用作生物技術領域的模式生物。近年來,研究者對聚球藻中的藻藍蛋白、多聚磷酸體、嗜鐵素等活性物質進行研究[5-7],明確了不同產物的發酵、提取條件,并利用其改善腸道菌群、干預炎癥性腸病,均取得了良好效果。然而,目前未見聚球藻營養成分分析的相關報道,組成成分和含量尚不明確,限制了其在食品應用領域的研究。

本文通過在實驗室條件下培養聚球藻,監測其生長情況;收集藻粉,通過化學分析和儀器分析方法系統地分析了聚球藻的營養成分,以期為聚球藻食品化研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食品級螺旋藻和小球藻粉 福清市新大澤螺旋藻有限公司;聚球藻 實驗室培養;Medium A青島海博生物技術有限公司;瓊脂 分析純，北京索萊寶科技有限公司;MgSO4·7H2O、KCl、NaNO3、NaCl、CaCl2、Tris-HCl、FeCl3·6H2O、EDTA·Na2、KH2PO4、Na2CO3、H3BO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、Co(NO3)2·6H2O、維生素B12、石油醚(30～60 ℃)、K2SO4、濃H2SO4、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍指示劑、NaOH、95%乙醇、無水乙醇、苯酚、葡萄糖(以上試劑均為國產分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

GXZ-280光照培養箱 寧波江南儀器廠;G154T全自動高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機有限公司;UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津公司;索氏抽提器、凱氏定氮儀 四川蜀玻集團有限責任公司;SevenCompact pH計 梅特勒-托利多國際集團;Dionex ISC-90離子色譜儀 美國賽默飛世爾公司;Alliance 2695高效液相色譜儀 美國沃特世公司;Agilent 7890A-5975C氣相色譜-四級桿質譜聯用儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 聚球藻培養 在實驗室中以Medium A為培養基,以照明日光燈做光源,光強100 μE/m2·s,溫度32 ℃,通以1% CO2(V/V)的空氣。固態培養時,添加1.2%瓊脂。

將生長10～15 d的聚球藻從固體培養基上接種至5 L血清瓶(初始OD750=0.08～0.10),在上述條件下培養至OD750>2.0以后擴大到20 L培養袋,培養7 d后進行收獲。

收獲的藻液進行離心分離(7000×g,6 min),收集沉淀,用蒸餾水清洗兩遍,然后通過冷凍干燥制備藻粉,研磨后置于-20 ℃密封保存做進一步分析。

1.2.2 聚球藻生長特性分析 以聚球藻培養所用Medium A為對照,利用分光光度計測定聚球藻在750 nm處的吸光值來監測其生長狀況,每24 h測定一次,比生長速率根據公式μ=ln(X1-X0)/(t1-t0)計算[8]。其中,X1和X0分別為藻液在t1和t0時的OD750。

1.2.3 成分分析 聚球藻主要成分分析參照GB 5009(2016),稍作改動。以相同方法同時測定螺旋藻和小球藻藻粉。

1.2.3.1 水分 水分測定采用直接干燥法。稱取1.000 g藻粉置于105 ℃干燥箱中烘至恒重(兩次質量差不超過2 mg)。

1.2.3.2 灰分與礦物質 總灰分測定采用灼燒法。稱取藻粉3.000 g,先在電熱板上以小火加熱使試樣充分炭化至無煙,然后置于高溫爐中,在550 ℃灼燒4 h。

鉀、鈣、鈉、鎂、磷、銅、鐵、鋅、硒等礦物質元素采用原子吸收法分析,在中國科學院海洋研究所分析測試中心完成。

1.2.3.3 蛋白質及氨基酸 總氮含量測定采用凱氏定氮法。稱取藻粉0.500 g,加入硫酸溶液消化,堿化蒸餾使氨游離,最后通過鹽酸標準溶液滴定并計算氮含量。粗蛋白含量(g/100 g)=總氮量×6.25。

水解氨基酸和游離氨基酸組成采用離子色譜法分析,在中國科學院海洋研究所分析測試中心完成。色譜條件:色譜柱:磺胺型陽離子樹脂;檢測波長:440和570 nm。

根據FAO/WHO建議的氨基酸評分標準模式和雞蛋蛋白的氨基酸模式,計算三種微藻的氨基酸評分、化學評分和必需氨基酸指數(EAAI)[9]。

1.2.3.4 脂質 采用索氏抽提法測定脂質含量。稱取藻粉2.000 g,經4 mol/L HCl水解后用石油醚經索氏抽提器提取。

聚球藻脂肪酸組成利用氣相色譜-質譜聯用儀分析,在中國科學院能源過程與工程研究所分析測試中心完成。色譜條件:色譜柱:DB-5 ms;載氣:MSD氦氣,FID氫氣;柱溫:120 ℃保持1 min,20 ℃/min程序升溫至325 ℃。質譜條件:EI離子源;溫度:300 ℃(離子源),150 ℃(四極桿);掃描范圍:30～550 m/z。

1.2.3.5 色素與色素蛋白 葉綠素和類胡蘿卜素:取0.010 g藻粉,加入5 mL甲醇,在4 ℃條件下提取1 h。以10000×g、15 min離心分離上清。重復提取直至上清不再呈現綠色(此時沉淀應為藍紫色)。以甲醇為空白測定470、665和720 nm處的吸光度,按照下式計算[10]:

Chl a(mg/L)=12.945(A665-A720)

Car(mg/L)=[1000(A665-A720)-2.86Chl a]/221

藻膽蛋白:取0.010 g藻粉,加入5 mL Na3PO4緩沖液(pH=7.0,含0.15 mol/L NaCl),用玻珠研磨機破碎細胞后提取1 h。以10000×g、15 min離心分離上清。重復提取直至上清無色。以緩沖液為空白測定562、615和652 nm處的吸光度,按照下式計算[11]:

藻藍蛋白(mg/L)=(A615-0.474A652)/5.34

別藻藍蛋白(mg/L)=A652-0.208A615)/5.09

藻紅蛋白(mg/L)=(A562-2.41PC-0.849APC)/9.62

1.2.3.6 維生素 聚球藻維生素A、維生素E、維生素K1、維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6以高效液相色譜法進行分析,在中國科學院海洋研究所分析測試中心完成。色譜條件參考國標GB 5009(2016)中維生素的測定。

1.3 數據處理

在本實驗室內完成的測定工作均重復三次,結果表示為平均值±標準偏差(SD);送檢結果以單次測定值表示。除另作說明,均以占藻粉干重的百分比表示。

2 結果與分析

2.1 生長特性

聚球藻在5 L血清瓶中的動態生長曲線如圖1所示。藻種從接種到血清瓶中進入延滯期,細胞通過增加酶和代謝產物水平來調節代謝過程,準備細胞分裂和光合作用[12]。當接種量增加,藻細胞生長環境適宜時,可以縮短這一過程[13]。從第4 d開始,藻細胞進入指數增長期,直到11 d,最大比生長速率達到1.023/d。之后細胞進入穩定期,OD750基本不再增加。13 d以后收獲,聚球藻藻粉收獲量(干重)為1.34 g/L。

圖1 聚球藻生長曲線

由于聚球藻對高光和高溫耐受性強[14],在實驗室條件下可以通過增加溫度和光照提高生長速率,通過控制接種量和培養環境,最終將收獲周期控制在7 d。

2.2 營養成分組成

2.2.1 基本成分分析 表1列出了聚球藻和螺旋藻、小球藻的營養成分。通過冷凍干燥獲得的藻粉含水量在4%,而現有相關藻粉標準[15]規定為含水量≤7%,因此聚球藻分含水量符合要求,能夠保持良好的質量。

表1 三種微藻基本成分組成(g/100 g DW)Table 1 Composition of general nutrients in three kinds of microalgae(mg/100 g DW)

如表1所示,三種微藻蛋白質含量在59.36%～67.25%之間,而脂質和總糖含量相對較低,分別為8.21%～14.82%和9.30%～14.20%。微藻的高蛋白含量是將其作為非傳統蛋白來源進行研究的主要原因[1],而總糖(淀粉、纖維素、多糖等)主要影響微藻產品的價值和消化性。微藻中的脂質含量受藻種和環境的影響變化較大(1%～40%);綠藻在特定條件下積累脂質[16],因此具有更高的脂質含量。Becker曾將一般食物與藻類基本構成進行對比[17],微藻整體呈現高蛋白、低脂、低碳水化合物的特點,聚球藻的基本成分組成表明其可以作為蛋白質的來源。

與螺旋藻和小球藻相比,聚球藻灰分含量最高,達到13.23%。微藻灰分與培養條件和成熟度有關,非限制條件下,微藻灰分占干重的4%～20%[18]。Ben-Amotz等[19]認為,微藻灰分含量與培養基鹽度呈正相關。聚球藻為海水藻,生長于高鹽環境,體內積累礦物質離子以維持滲透壓平衡,而且礦物質組成中,Ca和Na的含量最高,這與培養基組成是一致的。其他含量較高的元素包括K、Mg、P等(見表2),除此以外還檢測到微量的Se。由于微藻生長所需要的物質均來源于培養基,而Medium A中未添加含Se的成分,因此Se很可能來源于培養基用水或由外源帶入。與螺旋藻和小球藻相比,聚球藻呈現出低Fe、高Zn的特點,Medium A中添加的微量元素可能是較高Zn含量的來源,而Fe含量低可能是對大洋低鐵環境的生態適應造成的[20]。從營養學角度來看,礦物質是機體所需的無機元素,以較少的量來滿足多種不同的功能，它們涉及骨骼和牙齒的形成、肌肉收縮、蛋白質的合成和能量的產生[21]。聚球藻中所含的多種豐富礦物質可以很好地滿足機體需求。

表2 三種微藻礦物質含量(mg/100 g DW)Table 2 Content of minerals in three kinds of microalgae(mg/100 g DW)

2.2.2 蛋白質與氨基酸組成分析 蛋白質是生物體內的重要成分,水解后轉化成不同的氨基酸,用于細胞生長和修復,維持機體健康,并在一定條件下提供部分能量[21]。蛋白質的含量多少和質量高低是決定新食品原料營養價值的重要參考因素。聚球藻的粗蛋白含量高于小球藻,與螺旋藻類似,這一差別與微藻種類和培養條件有關,而且普遍用于食品中的N-Protein轉換因子6.25來源于蛋白質中含有16% N的假設,而忽略了非蛋白質氮的含量,比如結構蛋白、生物活性肽、游離氨基酸、核酸和微藻中發現的氨[21]。因此,為了更準確地評估聚球藻的蛋白質價值,本文測定了水解氨基酸和游離氨基酸的含量(圖2)。結果顯示,三者水解氨基酸和游離氨基酸含量分別為:聚球藻52.04%、1.60%;螺旋藻64.87%、0.84%;小球藻51.21%、0.82%。對比之后可以發現,聚球藻中粗蛋白含量與螺旋藻相似,而氨基酸含量卻低了12.83%,說明聚球藻中含有較多的非蛋白質氮,游離氨基酸含量測定結果也證明了這一點(表2)。

圖2 三種微藻水解氨基酸和游離氨基酸含量

聚球藻蛋白質含有全部的必需氨基酸(EAA)(表3),通過氨基酸評分和化學評分可知,聚球藻的第一限制氨基酸為甲硫氨酸+半胱氨酸,第二限制氨基酸為賴氨酸(氨基酸評分)和異亮氨酸(化學評分)。三種微藻第一限制氨基酸相同,但聚球藻中甲硫氨酸+半胱氨酸的含量更高,同樣蛋白質含量的情況下,其營養價值更高。

表3 三種微藻必需氨基酸組成評價Table 3 Composition of essential amino acids in three kinds of microalgae

2.2.3 脂肪酸組成分析 聚球藻總脂含量較低(8.21%),與螺旋藻接近而低于小球藻。一般來說,綠藻積累脂質的能力比藍藻強,且小球藻和螺旋藻的總脂含量接近于Tibbetts S M[22]報道。在某些條件下(如N限制),微藻脂質積累能力得到加強。由于氮的缺乏,細胞分裂受到抑制,而細胞同化的碳以脂質的形式在胞內累積[1]。生產中常利用細胞的這一特性來獲得目標脂質,如雨生紅球藻在N限制條件下總脂含量高達40%[23],目標產物蝦青素也隨之增加。

本文進一步分析了聚球藻脂肪酸的組成,一共鑒定出8種脂肪酸,其中包括3種飽和脂肪酸,3種單不飽和脂肪酸和2種多不飽和脂肪酸,不同脂肪酸所占比例差異較大,C16∶0和C18∶1含量最高(分別為59.04%和24.90%),兩者貢獻了80%以上的總脂肪酸,而其他6種占比不到20%(表4)。Sakamoto等[24]分析不同培養條件下聚球藻的脂肪酸組成,C16∶0和C18∶1含量分別可達57%和23%,34 ℃培養條件下未檢測到含2個以上不飽和鍵的脂肪酸,與本文結果一致。本研究中聚球藻飽和脂肪酸比例為60.94%,主要為C16∶0。有研究者認為,在生長周期延長的情況下,由于營養鹽限制,細胞將積累更多的飽和脂肪酸(如C18∶0)[25]。對不同溫度下聚球藻脂質組成的研究表明,不飽和脂肪酸的增加是細胞適應低溫環境的一種機制,它可以提高聚球藻對低溫的耐受性[24]。因此,微藻脂肪酸的組成具有較高的可塑性,可以通過控制條件實現預期結果。

表4 聚球藻脂肪酸組成(以占總脂肪酸百分比表示)Table 4 Composition of fatty acids in Synechococcus(%)

多不飽和脂肪酸中,含量較高的C18∶2為3.75%。C18∶2無法直接通過人體代謝途徑合成,必須從外界攝入,因此對營養健康尤為重要;而同樣重要的C18∶3此次分析中未檢出。分析不同溫度和光照條件下聚球藻的脂質組成[24],結果顯示在低溫(22 ℃)高光照(250 μE/m2·s)條件下C18∶3含量達到19%,而高溫(34 ℃)低光照(50 μE/m2·s)條件下C18∶3未檢出。C18∶2和C18∶3作為EPA和DHA的前體,可為其合成提供原料。此外,有研究者利用轉基因技術通過聚球藻生產γ-亞麻酸和硬脂四烯酸,得到總脂含量11.64%的硬脂四烯酸[26]。現有研究展示了聚球藻食品應用的良好前景;然而,目前聚球藻的大規模培養未得到實踐,現有的收集方法耗能較高,尚不能作為食品原料使用，限制了其進一步研究和利用。

2.2.4 色素與色素蛋白 聚球藻是藍藻中的一員,其主要特征色素為藻膽蛋白[27](包括藻藍蛋白、藻紅蛋白和別藻藍蛋白),葉綠素和類胡蘿卜素相對含量較少。因此,表5比較了聚球藻和同為藍藻的螺旋藻的主要色素組成。

表5 聚球藻和螺旋藻中主要色素含量(g/100 g DW)Table 5 Composition of main pigments in Synechococcus and Spirulina(g/100 g DW)

與螺旋藻相比,聚球藻的藻藍蛋白、類胡蘿卜素含量較高,別藻藍蛋白、藻紅蛋白和葉綠素含量較低,色素含量總體差別不大(表5)。微藻中的色素是分類的重要特征也是其食品應用的重要領域,目前藻藍蛋白也是螺旋藻應用中的主要成分[28]。聚球藻的色素組成表明了其在食品中應用的物質基礎。同時通過聚球藻快速倍增的特點可以提高藻藍蛋白的生產效率,降低工業生產成本。葉綠素a是直接參與光合作用的色素,在光照強度高的情況下含量減少,而次生類胡蘿卜素增加,能夠保護藻體免受強光傷害[1]。聚球藻耐高光照,在200 μE/m2·s的光照條件下仍可以生長。實驗室培養條件(光照強度100 μE/m2·s)下,其類胡蘿卜素含量高于螺旋藻。

2.2.5 維生素 維生素是人體為維持正常生理功能而必須從食物中獲得的一類微量有機物質,在人體生長、代謝、發育過程中發揮著重要作用[21]。微藻被認為含有幾乎所有的必需維生素,并且可以在光合作用過程中產生維生素E,而其他非光合微生物則不能[29]。本文檢測了聚球藻中的多種維生素(表6),除維生素A外均有檢出。與螺旋藻和小球藻相比[1],較高的維生素E提升了聚球藻的營養價值。由上文可知,聚球藻中含有一定量的類胡蘿卜素,而維生素A未檢出,這可能是由于聚球藻中β-胡蘿卜素(維生素A原)含量較低。培養條件對維生素的積累有一定影響,降低光照可以使微綠球藻中維生素E含量增加,然而,低光照可能會影響藻體生長[29]。此外,藻粉干燥方法的選擇也會對維生素含量產生影響,特別是一些熱敏性維生素[1]。

表6 三種微藻中主要維生素含量(mg/100 g DW)Table 6 Main composition of vitamins in three kinds of microalgae(mg/100 g DW)

3 結論

本文分析了聚球藻PCC7002的營養成分,并將部分結果與螺旋藻和小球藻進行對比。結果顯示,聚球藻具有高蛋白(65.79%)、低碳水化合物(9.30%)、低脂肪(8.21%)、灰分含量高(13.23%)的特點,甲硫氨酸+半胱氨酸為第一限制氨基酸,多不飽和脂肪酸含量低(5.6%),而藻藍蛋白含量較高(15.81%),并含有多種礦物質和維生素,其營養價值與螺旋藻和小球藻相當。此外,聚球藻生長速率快,生產效率高,其微小的個體為功能成分的提取提供了方便。雖然目前針對聚球藻的食品應用研究剛剛起步,研究過程中有很多問題尚待解決,但是本文中營養成分分析的研究結果顯示聚球藻具有良好的開發應用價值,有潛力作為食品和食品添加劑使用。