PhIP化學模型體系中前處理及UPLC-MS檢測方法的研究

陳妍方,趙月亮,張娜娜,范大明,,*,李利潔,趙建新,5,張 灝,5

(1.江南大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學,國家功能食品工程技術研究中心,江蘇無錫 214122;3.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;4.香港大學生命科學學院,香港薄扶林 SAR;5.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

在高溫烹調過程中,肉制品中的氨基酸、肌酐和葡萄糖三種成分會產生雜環胺,是一類具有致癌、致突變性的多環芳香族化合物[1]。其中,2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶(PhIP)是高溫處理肉類產品時生成的含量最豐富的雜環胺。1999年,國際癌癥研究機構將PhIP劃為2B類潛在致癌物[2],Sinha等人的研究表明,攝入PhIP增加了消費者的患癌風險,其攝入量與患病率存在正相關關系[3-4]。隨后,美國健康和人道服務部將PhIP列為合理預期的人類致癌物質,并將其列入國家毒理學計劃[5]。因此,需要對烹調肉制品中產生的PhIP進行定量分析,為相應抑制手段的探究提供依據。

由于肉類制品中含有大量的油脂、蛋白質等物質,體系本身十分復雜,且其中的PhIP含量屬于ng/g水平,故需要對其進行復雜前的處理,才能進行后續的檢測和分析[6]。食品體系的復雜性給PhIP的相關的反應機理探究增加了困難,為了減少干擾,Shioya等人[7-8]首次簡化了實驗對象,采用氨基酸、肌酸和葡萄糖三種PhIP的前體物質組成了化學模型,研究其形成機制。化學模型體系為反應機理層面的研究排除了很多干擾,被廣泛采用[9-10]。

目前,化學模型體系的前處理多采用液液萃取結合SPE固相萃取的方法,萃取后收集反應液,過固相萃取小柱后氮吹。但此方法的操作精度要求較高,也會有洗脫不凈的情況出現,均會直接導致測得的PhIP含量偏低。復雜的處理步驟會增大體系中PhIP損失的概率,也會降低實驗的可重復性和回收率[11-12]。本文在傳統PhIP檢測方法的基礎上,建立了一種不需要固相萃取小柱的樣品處理方法。此方法將會簡化操作過程,提高可重復性,可作為一種特定的檢測化學體系中PhIP的新型方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯丙氨酸、葡萄糖、肌酸酐、乙酸乙酯、NaOH 國藥集團化學試劑有限公司;甲醇、乙酸銨 江蘇博美達生命科學有限公司;2-氨基-1-甲基-6苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP) Toronto Research Chemicals(Toronto,加拿大)。

Thermo HAAKE AC200-S13油浴鍋 美國Thermo公司;79480-3冷凍干燥系統 CONCO公司;Waters超高液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀(UPLC-TQD) 美國Waters公司;ACQUITY BEH C18(1.70 μm，50 mm×2.10 mm)、ACQUITY BEH T3(1.70 μm,50 mm×2.10 mm)、ACQUITY BEH phenyl(1.70 μm,50 mm×2.10 mm)色譜柱 美國Waters公司;QSC-12T氮吹儀 泉島公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 參考蔣智等[6]的方法,精確稱取10.0 mg的PhIP標準品,用甲醇進行溶解,配成濃度為100 μg/mL溶液。將標準液用甲醇進行梯度稀釋,配制成2.5、5、10、20、50、75 mg/mL的標準溶液。

1.2.2 PhIP化學模擬體系的建立 本研究中的化學模型以李利潔等[13]的方法為參考并進行調整。將20 mmol/L肌酸酐、10 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L苯丙氨酸溶于蒸餾水中,配成100 mL的反應體系。在有配墊片的螺口玻璃瓶中加入10 mL反應液,擰緊瓶蓋,設定油浴鍋加熱條件為128 ℃、油浴2 h,冷卻至室溫。

1.2.3 樣品前處理 取1.2.2中油浴加熱后的反應溶液于冷凍干燥機中凍干,凍干程序為:0～4 h,-40 ℃;4～19 h,-30 ℃;19～34 h,-10 ℃;34～38 h,10 ℃;38～42 h,20 ℃。以凍干前反應液的體積為依據,每10 mL反應液得到的凍干樣品中加入2 mL的2 mol/L NaOH和2～8 mL乙酸乙酯,形成堿性萃取環境。將萃取體系震蕩3 min,超聲處理4～12 min,6000 r/min離心5 min,取上清液氮吹,去除溶劑,加入0.20 mL甲醇震蕩溶解,用0.22 μm有機濾膜進行過濾,用超高效液相色譜串聯四級桿質譜法(UPLC-MS)進行PhIP含量測定。

1.2.4 化學模型體系中PhIP的UPLC-MS檢測條件

1.2.4.1 液相色譜條件 參照李利潔等[13]的方法對液相條件進行調整,色譜柱為Waters BEH phenyl柱(50 mm×2.10 mm,1.70 μm),流速為0.30 mL/min,設定柱溫為35 ℃,進樣量為10 μL。流動相為:乙腈(A),0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫程序為:0～8 min,10% A;8～9 min,70% A;9～9.5 min,10% A。在下次進樣前,用10% A液保持5 min,用于平衡柱子。

1.2.4.2 質譜條件 參照蔣智等[6]的方法對質譜檢測條件進行優化。離子源為ESI+,采用多反應監測模式進行檢測;設定離子源溫度為120 ℃;噴霧電壓2.8 V;毛細管電壓為2.50 kV;脫溶劑溫度400 ℃;脫溶劑氣體流速700 L/h;錐孔氣體流速50 L/h;碰撞氣體流速0.30 mL/min。

1.3 數據處理

所有實驗均重復三次,結果數據用平均值±標準偏差的形式表示,數據處理采用Microsoft Excel 2010;圖表繪制采用軟件GraphPad Prism;顯著性分析采用軟件SPSS Statistics;LC-MS圖譜分析采用軟件Masslynx V4.1。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇

已有較多研究對不同樣品體系中的PhIP前處理方法進行了優化。Calbiani等[16-18]不斷地改進固相萃取方法的萃取劑種類、流動相以及柱條件等,提高了分析的可重復性和穩定性。但Khan等[19]認為固相萃取法溶劑量很大且凈化步驟復雜,故采用加壓流體進行提取,使雜環胺的回收率高達62%。本研究提出了一種無需使用固相萃取柱的前處理方法,由于PhIP可溶于蒸餾水和有機溶劑,故先采用凍干法對將大體積的反應體系濃縮,又可同時去除體系中的水分,使得PhIP更容易被萃取進入乙酸乙酯層。隨后,直接收集乙酸乙酯層溶液,進一步氮吹濃縮,使用甲醇復溶,過膜后待測。

2.1.1 提取溶劑及用量的選擇 提取雜環胺常用的溶劑主要有:乙酸乙酯[20-21]、二氯甲烷[22]、二氯甲烷(含5%甲苯)[23]等。本方法中濃縮萃取后的反應液需要取上層液體氮吹,但二氯甲烷密度大,渦旋混合離心后萃取效率差,而采用乙腈回收率較低,且不易用氮氣吹干,故選擇密度小且易于氮吹的乙酸乙酯作為萃取溶劑。由于PhIP的疏水性和親水性取決于所處介質的pH,隨著pH升高,疏水性增強,PhIP更易溶解于有機提取溶劑中[24]。為了提高萃取率,本方法向乙酸乙酯中加入2 mol/L NaOH構成堿性環境,以促進萃取。在10 mL的化學模型反應體系中,固定NaOH用量,考察乙酸乙酯用量(2、3、4、5、6、7、8 mL)對PhIP提取效果的影響。圖1為乙酸乙酯用量對PhIP提取量的影響。如圖1可知,提取到的PhIP濃度隨乙酸乙酯使用量的加大,呈現上升的趨勢,但當提取劑用量大于5 mL時,PhIP濃度隨萃取劑用量緩慢上升 。此結論與肖正華等[25]結果一致,結合后續濃縮步驟與成本綜合考慮,選取每10 mL的反應溶液進行前處理,以加入5 mL乙酸乙酯為宜。

圖1 乙酸乙酯用量對PhIP濃度的影響

2.1.2 萃取時間的選擇 取10 mL反應液,加入5 mL乙酸乙酯和2 mL NaOH,振蕩萃取4、6、8、10、12 min后,測定PhIP的萃取效果,結果見圖2。發現隨萃取時間的延長,PhIP濃度先增加后減少,在10 min時提取量達到峰值。此結果與鄧燕莉等[26]的結論一致,體系中非PhIP的雜質被萃取的量隨著萃取時間的延長而增加了,導致了PhIP的純度下降。所以萃取時間選擇為10 min。通常,采用固相萃取法進行樣品前處理時,萃取時間長達2～3 h[6]。與固相萃取法相比,本法將萃取時間縮短為10 min,對溶液進行簡單快捷又有效地萃取,簡化了實驗。

圖2 萃取時間與PhIP提取量的關系

2.2 質譜條件的確定

由于化學模型體系中的PhIP屬于痕量物質,對PhIP的檢測采用串聯三重四級桿質譜儀進行。通過針泵注射1 μg/mL標準液進樣,由于被測物質PhIP結構中含有氨基和亞氨基的電離特性,檢測采用ESI+模式。蔣智等[6]的實驗表明,離子強度隨毛細管電壓的升高而逐漸增強,在電壓達到2.5 kV時,離子強度趨于穩定;在較低的碰撞能量下,能量不足,導致得不到PhIP的碎片離子,當錐孔電壓調節到35 V時,可以獲得穩定的分子離子m/z 225。對PhIP的母離子進行全掃描可得到子離子,進入二級質譜后受到碰撞能量的作用,失去-CH3會形成質荷比為210.1的離子,失去-HCN基團形成質荷比為183.1的離子,這兩個離子是PhIP的特征離子,選擇信號最強的225.1>210.1作為定量離子。在多反應監測模式下,能夠通過篩選目標物的特征離子來定性定量,可以提高檢測方法的靈敏度和選擇性。

圖3 PhIP的碎片離子質譜圖

2.3 PhIP檢測色譜條件的確定

2.3.1 不同色譜柱對分離效果的影響 實驗中采用BEH C18、BEH T3和BEH phenyl三種分離原理不同的色譜柱對樣品體系中的PhIP進行分離,PhIP的信號強度來對色譜柱進行篩選,結果如圖4所示。由圖4可知,BEH C18、BEH T3、BEH phenyl三種色譜柱得到的PhIP保留時間分別為3.44、3.49、4.49 min。但是使用BEH C18柱進行分離時,拖尾現象非常明顯。BEH T3柱的拖尾不明顯,色譜峰卻有輕微分叉。C18柱和T3柱分離效果不佳,是由于這兩種色譜柱只能在反相UPLC條件下分離和保留極性有機化合物,對PhIP這樣的極性雜環胺分離效果較差。而采用BEH phenyl柱得到的峰型對稱性好,沒有分叉現象。這與滿正印等[27]的結論相似,可能由于苯基柱能形成p-p共軛相互作用,對極性芳香族化合物的保留能力比C18柱和T3柱強。此外,苯基柱對含有苯環的目標物分離更有選擇性,更利于PhIP的分離[27]。因此,最終選擇BEH phenyl柱進行PhIP的色譜分離。

圖4 采用不同色譜柱——BEH C18(a)、BEH T3(b)、BEH phenyl(c)對PhIP的分離效果影響

2.3.2 流動相對分離效果的影響 本研究固定乙腈為流動相A,分別考察了0.1%甲酸水和3 mmol/L乙酸銨為流動相B對PhIP的分離效果。Shah等[24]采用乙酸銨作為流動相,因其能使峰型得到改善,溶劑峰小,降低干擾性。乙酸銨容易殘留在柱子中,對色譜柱損傷較大,且成本高,價錢昂貴。仲伶俐等[28]采用選擇phenyl色譜柱測定水果中萘衍生物,發現用乙腈-0.1%甲酸作為流動相能夠改善色譜峰形,且對保留值并無影響,故本實驗對比了0.1%甲酸水和乙酸銨分離PhIP的效果,結果如圖5所示。由圖5可知,采用0.1%甲酸水作為流動相B時,縮短了保留時間,且基線比采用乙酸銨時穩定,峰型較好。0.1%甲酸能提供質譜離子化時所需的H+,促進分子的電離,保證化合物在質譜下的離子化,大大增強檢測信號的強度[29-30]。故本研究采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。

圖5 采用流動相3 mmol/L乙酸銨(a)和0.1%甲酸水(b)對PhIP的UPLC-MS/MS分離效果的影響

2.4 樣品前處理與檢測方法的評價

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限 以對應的標準液濃度為X軸,PhIP峰面積為Y軸繪制標準曲線,其線性關系和相關系數見表3,結果顯示,本方法的線性范圍為0.5～15 ng/mL,決定系數為0.999。添加標準溶液后,測得的PhIP定量限為0.332 ng/mL,檢出限為0.110 ng/mL。

表3 凍干法應用于PhIP分析的方法學數據Table 3 Methodology data for the freeze-drying method applied to the analysis of PhIP

2.4.2 回收率和精密度 向空白樣品中添加10、15、30 ng/mL三個濃度的PhIP標準品,測定的平均回收率見表4。加標水平為10、15、30 ng/mL時,新方法的平均收率分別為78.16%、81.22%、82.03%,試驗中檢測PhIP的相對標準偏差為6.32%、5.40%、4.28%,實驗結果表明,凍干萃取法的穩定性和可重復性均較好。

表4 凍干法應用于PhIP分析的平均回收率實驗結果Table 4 Mean recoveries of freeze-drying method applied to the analysis of PhIP

3 結論

本研究對化學體系中PhIP的前處理和UPLC-MS檢測方法進行了優化,重點研究了濃縮方式、萃取劑用量、萃取時間三個因素對PhIP提取效果的影響。將樣品凍干處理后,采用NaOH-乙酸乙酯2∶5的比例進行萃取,可使PhIP得到比較完全的萃取。采用Waters BEH phenyl色譜柱,以乙腈-0.1%甲酸為流動相進行梯度洗脫,可以得到對稱性好的峰型。本方法檢測PhIP的線性范圍為0.5～15 ng/mL,決定系數為0.999,檢出限為0.110 ng/mL,定量限為0.332 ng/mL,在加標水平為10、15、30 ng/mL時的平均收率分別為78.16%、81.22%、82.03%,相對標準偏差(RSD)分別為6.32%、5.40%、4.28%。本方法對樣品前處理過程和檢測條件進行了優化,可用于分析化學體系中的PhIP含量。目前國內對于化學體系中PhIP檢測方法的報道還很少,本法的建立為探究化學體系中PhIP的有效抑制方法提供了檢測依據。本方法操作簡便、可重復性高,可作為測定化學模型中PhIP的有效方法。