體外模擬胃腸消化對不同熱處理荷葉中酚類物質釋放量及抗氧化活性的影響

王智能 王 允 吳光旭,2,* 吳慶華,2 蘇東曉 李 利楊華林 陳 莎

(1 長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434020；2 長江大學荊楚特色食品研發中心，湖北 荊州 434020；3 廣州大學化學化工學院，廣東 廣州 510610)

蓮(Nelumbonucifera)睡蓮科蓮屬，是一種常見的多年生水生草本植物，主要分布于東亞和印度[1-2]。荷葉是蓮的葉，是重要的藥食兩用資源[3]。傳統醫學典籍記載荷葉具有清暑化濕、生發清陽和涼血止血的功能[3-4]?，F代醫學研究報道，荷葉還具有抗氧化[5]、降脂減肥[6]、抗人類免疫缺陷病毒[7]、抗癌[8]、抑菌[9]和治療心血管疾病[10]等多種功效，保健用途廣泛，已成為近年來中藥和保健食品的研究熱點。研究表明，荷葉富含蘆丁、花青素、槲皮素、單寧和紫云英甘等酚類物質[11-14]，以及生物堿、木脂素等生物活性物質，具有良好的生物活性和生理功能[15]。然因其采收季節性強，僅有少部分被用于醫療和食品等行業，其余自然凋零于池塘中或被收集焚燒而未被利用，不僅造成資源浪費，還污染環境[16]。因此，提取荷葉中的酚類物質對于促進人體健康和解決資源浪費問題具有重大意義。

目前，植物中的酚類物質主要通過乙醇、丙酮和乙酸乙酯等有機溶劑進行提取[17]，如荔枝果肉中的游離酚可選用70%乙醇溶液(料液比 1∶3，w/v)進行提取，而結合酚可采用酸水解法和堿水解法進行提取[18-19]。植物酚類物質可作為膳食多酚的來源，通過口服方式進入人體，到達胃和腸道中進行轉化。體外模擬胃腸消化是通過調節pH值，添加酶和無機鹽來模擬人體胃腸道環境，進一步反映食物及食物中酚類物質在人體胃腸道中的代謝情況。研究表明，胃腸道中的消化酶、pH值和無機鹽均會影響食物及酚類物質在人體胃腸道中的吸收與釋放[20-21]。Su等[22]發現模擬胃液和腸液消化處理均提高了荷葉的總酚釋放量，且模擬腸液消化對于不同生長階段荷葉中總黃酮的釋放量還具有促進作用。此外，食物的不同加工方式也會影響其活性成分的釋放[23-25]。鄭慧等[26]發現蜂花粉多酚溶出量隨粉碎粒徑的減小而增加，粉碎可提高溶出多酚在腸液消化過程中的保留率。目前關于荷葉中酚類物質的研究主要以新鮮荷葉為原料進行探究，對于經熱加工處理的荷葉，通過模擬胃腸消化來探究荷葉中酚類物質的釋放及其抗氧化活性的影響未見報道。

本研究采用體外模擬胃腸消化法探究不同熱處理后的荷葉中總酚和總黃酮釋放量的變化，以及其鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power，FRAP)和ABTS自由基清除能力，以期為荷葉的開發利用提供技術支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

新鮮、無污染的荷葉于2017年8月中旬采集于湖北荊州。

胃蛋白酶、胰蛋白酶、蘆丁和沒食子酸均購自美國Sigma公司；二硫代蘇糖醇(DL-Dithiothreitol，TPTZ)、2，2’-聯氮-雙-乙基苯并噻唑-6-磺酸[2，2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6)-sulfonic acid, ABTS]、水溶性維生素E(Trolox)、福林酚試劑和硫酸亞鐵(GR)均購自山東西亞化學工業有限公司；其他試劑均為分析純，購自天津市大茂化學試劑廠。

1.2 主要儀器與設備

FW100高速萬能粉碎機，天津恒瑞科教儀器有限公司；GZX-9420 MBE鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司；FA1104電子天平，上海天平儀器廠；KQ100DE超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；BR-2000渦旋振蕩器，上海伯樂生命醫學產品有限公司；5430R高速冷凍離心機，美國Eppendorf公司；DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設備有限公司；PB-10型pH計，德國Sartorius公司；UV-2100紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 荷葉前處理試驗 荷葉生長過程分為立葉期、營養生長期、成熟期和衰亡期，荷葉直徑大小可以代表其不同生長期，6、7、8月份荷葉的直徑分別為10～20、30～40、50～60 cm[27]，6、7月份為營養生長期，8月份為成熟期。挑選新鮮、外觀較好，直徑分別為15±3、34±3、56±4 cm的荷葉進行處理。真空微波處理：采用 50Hz 微波2 min，依次記作V15組、V34組、V56組；濕熱蒸汽處理：采用100℃沸水的水蒸汽熏蒸 5 min，依次記作H15組、H34組、H56組；煮沸處理：采用100℃沸水煮沸5 min，依次記作B15組、B34組、B56組。處理后將所有荷葉樣品參考劉慧娟等[16]和Su等[22]的方法60℃熱風干燥至荷葉樣品中水分含量為4.5%～5.0%。將上述干燥后的荷葉樣品分別粉碎，過60目篩，樣品粉末于-18℃冰箱中保存備用。

1.3.2 荷葉體外消化處理試驗

1.3.2.1 去離子水提取 稱取2.00 g 1.3.1中各處理組荷葉粉末，分別按照1∶15(質量體積比)的比例加入去離子水，振蕩混勻后于37℃條件下恒溫振蕩(120 r·min-1)2 h，然后5 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，并于-20℃冰箱中保存備用，以此作為對照。

1.3.2.2 模擬胃液消化處理 參考Fu等[28]的方法并略作修改。體外模擬胃消化液的制備：準確稱取2.0 g NaCl和3.2 g胃蛋白酶，加入預先用900 mL去離子水和7.0 mL濃鹽酸充分混合好的溶液中，通過磁力攪拌器使其充分溶解，再用6 mol·L-1HCl調節pH值至1.2，最后將溶液轉移并定容至1 000 mL，充分搖勻后靜置過夜，即為體外模擬胃消化液。

消化處理：稱取2.0 g 1.3.1中各處理組荷葉粉末，按照1∶15 g·mL-1的比例加入過夜靜置的模擬胃消化液，振蕩混勻后于37℃條件下恒溫振蕩(120 r·min-1)2 h，然后5 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，并于-20℃冰箱中保存備用。

1.3.2.3 模擬腸液消化處理 參考Fu等[28]的方法并略作修改。體外模擬腸消化液的制備：準確稱取6.8 g KH2PO4于燒杯中，加入250 mL去離子水，并通過磁力攪拌使其充分溶解，再加入190 mL 0.2 mol·L-1NaOH溶液和400 mL去離子水，充分混勻后加入10.0 g胰酶，待胰酶充分溶解后用NaOH溶液或HCl溶液調節溶液pH值至7.5±0.1，最后用去離子水定容至1 000 mL，充分搖勻，即得體外模擬腸消化液。

消化處理：稱取2.0 g 1.3.1中各處理組荷葉粉末，按照1∶15 g·mL-1的比例加入模擬腸消化液，振蕩混勻后于37℃條件下恒溫振蕩(120 r·min-1)2 h，然后5 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，并于-20℃冰箱中保存備用。

1.3.3 荷葉總酚釋放量測定 參照文獻[29]的方法并略作修改。吸取250 μL模擬消化處理或對照樣品上清液，加入1.0 mL去離子水和250 μL福林酚試劑，混勻后靜置6 min，再加入2.5 mL Na2CO3溶液(質量體積比為70 g· L-1)和2 mL去離子水，振蕩混勻后室溫條件下暗室反應 90 min，測定其在760 nm波長處的吸光度值?？偡俞尫帕恳詻]食子酸為標準，按照每克樣品中沒食子酸釋放量當量(gallic acid equivalent，GAE)表示，單位為mg·g-1。

1.3.4 荷葉總黃酮釋放量測定 參照文獻[29]的方法并略作修改。取3.0 mL去離子水，加入600 μL模擬消化處理或去離子水提取上清液和180 μL 50 g·L-1NaNO2溶液，混勻靜置6 min后加入360 μL 100 g·L-1AlCl3·6H2O溶液，反應5 min后再加入1.2 mL 1 mol·L-1NaOH溶液，用去離子水補至6.0 mL，測定其在510 nm波長處的吸光度值?？傸S酮釋放量以蘆丁為標準品，每克樣品中所含蘆丁質量當量(rutin equivalents，RE)表示，單位為 mg·g-1。

1.3.5 荷葉FRAP抗氧化能力測定 參考Thaipong等[30]的方法。準確吸取0.6 mL樣液，加入5.4 mL FRAP工作液后充分搖勻，避光保存30 min，測定其在593 nm波長處的吸光度值。以硫酸亞鐵作為標準品繪制標準曲線，計算各樣品的FRAP抗氧化能力值，單位為 μmol FeE·g-1。

1.3.6 ABTS自由基清除能力的測定 參考Thaipong等[30]的方法。準確吸取1.2 mL模擬消化處理或去離子水提取上清液，加入4.8 mL ABTS工作液，振蕩混勻后靜置6 min，測定其在734 nm波長處的吸光度值。以Trolox為標準品繪制ABTS自由基清除率標準曲線，計算樣品ABTS抗氧化能力值，單位為mmol TE·g-1。

1.4 數據分析

所有試驗均平行測定3次，結果以平均值±標準差(M±SD)表示。采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析，并以SNK檢驗比較各組間顯著性差異，顯著性水平P=0.05。

2 結果與分析

2.1 模擬體外消化對不同熱處理的荷葉總酚釋放量的影響

由圖1可知，相同消化方式不同熱處理下，V56組荷葉中總酚釋放量最高，其次是V34組，B15組最低；相同熱處理不同消化方式下，與去離子水組(DW)相比，模擬腸液消化處理(SIF)能增加不同熱處理組荷葉總酚的釋放量，模擬胃液消化處理(SGF)增加真空微波處理組荷葉的總酚釋放量和降低煮沸處理組荷葉中總酚釋放量，而對濕熱蒸汽熱處理組荷葉中總酚釋放量影響較小。此外，直徑最大的荷葉(V56組、H56組、B56組)總酚釋放量最高，直徑最小的荷葉(V15組、H15組、B15組)總酚釋放量最低。綜上可知，真空微波處理組對荷葉中總酚釋放量的提高效果最好，荷葉直徑越大，其酚類釋放量越高，模擬腸液消化處理能增加總酚釋放量。

注：不同小寫字母表示相同消化處理下不同樣品間差異顯著(P<0.05)。下同。Note：Different lowercase letters indicate significantly difference within the same treatment group at 0.05 level. The same as following.圖1 模擬體外消化對不同熱處理的荷葉中總酚釋放量的影響Fig.1 Effects of simulated in vitro digestion on total phenolics release in lotus leaves with different heat treatment

2.2 模擬體外消化對不同熱處理的荷葉總黃酮釋放量的影響

由圖2可知，在荷葉直徑相等和消升方式相同的情況下，不同熱處理中，真空微波組(V56組、V34組和V15組)荷葉總黃酮釋放量高于濕熱蒸汽組(H56組、H34組和H15組)和煮沸處理組(B56組、B34組和B15組)，其中，V56組荷葉總黃酮釋放量最高，B15組最低；在相同熱處理不同消化方式下，與DW組相比，模擬胃液消化使真空微波、濕熱蒸汽和煮沸處理組中荷葉的總黃酮含量降低，而模擬腸液消化則提高其總黃酮的釋放量。在不同熱處理相同消化方式下，真空微波處理組中的總黃酮釋放量顯著高于濕熱蒸汽和煮沸處理組，此外，直徑較大的荷葉(V56組、H56組、B56組)總黃酮釋放量最高，直徑最小的荷葉(V15組、H15組、B15組)總酚釋放量最低。綜上，真空微波處理較其他熱處理方式的提取效果好，荷葉總黃酮釋放量隨著荷葉直徑增大而增加；與去離子水組(DW)相比，模擬胃液消化處理(SGF)會降低不同熱處理組荷葉中總黃酮的釋放量，而模擬腸液消化處理(SIF)會增加荷葉總黃酮釋放量。

圖2 模擬體外消化對不同熱處理的荷葉中總黃酮釋放量的影響Fig.2 Effects of simulated in vitro digestion on total flavonoids release in lotus leaves with different heat treatment

2.3 模擬體外消化對不同熱處理的荷葉FRAP抗氧化能力的影響

由圖3可知，相同消化方式不同熱處理下，真空微波組荷葉的FRAP值顯著高于濕熱蒸汽處理組和煮沸處理組。DW和SIF中V56組荷葉的FRAP抗氧化能力最強；SGF中V56組和H56組均高于其他熱處理組，但二者無顯著差異；在DW、SGF和SIF中，濕熱蒸汽處理組和煮沸處理組荷葉FRAP抗氧化能力由強到弱依次分別為H56>H34>H15和B56>B34>B15，這與其總酚含量測定結果一致。相同熱處理不同消化方式下，濕熱蒸汽處理組中H56的FRAP抗氧化能力在模擬胃液消化中增強，并與真空微波V56相比無顯著性差異。此外，荷葉的抗氧化能力隨荷葉直徑的增大而增強，其中直徑較大的荷葉(V56組、H56組、B56組)FRAP抗氧化能力較高，直徑最小的荷葉(V15組、H15組、B15組)FRAP抗氧化能力較低。綜上表明，不同熱處理方式對荷葉的FRAP抗氧化能力有顯著影響，其中真空微波處理效果最好；此外，模擬胃液消化對于濕熱蒸汽組中荷葉的抗氧化能力影響最大，對于真空微波和煮沸處理組中荷葉的FRAP抗氧化能力影響較小，模擬腸液消化則對于真空微波、濕熱蒸汽和煮沸處理組中荷葉FRAP抗氧化能力的影響均較小。

圖3 模擬體外消化對不同處理的荷葉FRAP抗氧化能力的影響Fig.3 Effects of simulated in vitro digestion on the antioxidant capacities of FRAP in lotus leaves with different heat treatment

2.4 模擬體外消化對不同熱處理的荷葉ABTS抗氧化能力的影響

由圖4可知，相同消化方式不同熱處理下，DW、SGF和SIF中V56組的ABTS值顯著高于其他熱處理組，這與其總酚含量測定結果相一致。DW、SGF和SIF組中濕熱蒸汽處理和煮沸處理的荷葉ABTS抗氧化能力由強到弱依次分別為H56>H34>H15和B56>B34>B15，這與FRAP測定結果相一致。相同熱處理不同消化方式下，SIF中真空微波組、濕熱蒸汽組和煮沸組荷葉的ABTS抗氧化能力均強于DW和SGF。此外，荷葉直徑越大其抗氧化值越高，其中，直徑為56 cm的荷葉的ABTS抗氧化能力最強，這與其總酚和FRAP抗氧化能力測定結果相一致。綜上表明，熱處理對荷葉的抗氧化能力具有顯著影響，其中真空微波處理能顯著提高荷葉的抗氧化能力。模擬腸液消化對于真空微波、濕熱蒸汽和煮沸處理組中荷葉的抗氧化能力具有積極影響，能顯著提高荷葉的抗氧化能力，而模擬胃液消化則對于真空微波處理組中荷葉的抗氧化能力有較大影響，顯著降低其抗氧化能力，但抗氧化活性仍高于濕熱蒸汽和煮沸處理組。

圖4 模擬體外消化對不同熱處理的荷葉ABTS抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of simulated in vitro digestion on the antioxidant capacities of ABTS in lotus leaves with different heat treatment

3 討論

植物中的酚類化合物是植物體內的次生代謝產物，具有多元酚羥基結構，這類化合物的穩定性會受光、熱、氧氣及pH值等多種因素的影響， 這些因素使其活性物質損失，導致其營養價值降低[31]。新鮮果蔬可通過直接曬干、烤干、熱風干燥和微波干燥等多種加工方式進行脫水干燥，但不同加工方式會影響其活性物質的釋放量。研究表明，熱處理可能會增大細胞間的孔隙[32-33]，促進值物中酚類物質的溶出和釋放，此外，熱處理還能使植物細胞壁破裂，改變其萃取性，使得酚類化合物更容易釋放[34]?？偡雍康脑黾舆€可歸因于高溫使多酚氧化酶失活，酶催化活性被破壞，酚類化合物無法聚合，阻止酚類化合物參與褐變反應[35]。本研究通過分析不同熱處理荷葉中酚類釋放量及抗氧化活性的影響來選擇荷葉干制的最優方法，結果顯示，真空微波處理的荷葉干燥效果最好，荷葉直徑越長，荷葉總酚和總黃酮釋放量越高，V56組荷葉中總酚、總黃酮釋放量均高于其他處理組。

食物在體內消化吸收和代謝過程比較復雜，其酚類物質釋放量和組成會發生較大變化，直接影響其生物活性[36]。食品中既含有游離酚，也含有結合酚[19]。游離酚可能在熱處理過程中發生聚合或降解，而結合酚可能在消化過程中被釋放出來。研究表明，胃腸環境對酚類物質釋放有較大的影響, 山楂通過胃腸消化后其總酚含量會顯著增高[37]。本試驗結果表明，與對照組相比，模擬胃液消化處理降低了荷葉中總黃酮釋放量，但增加了總酚釋放量，而模擬腸液消化顯著增加了荷葉中總酚和總黃酮釋放量，這可能是由于黃酮類物質與蛋白質結合形成了類黃酮-蛋白酶復合物，從而影響其釋放[38]。

抗氧化活性是體系中所有抗氧化物質共同發揮作用的結果，胃腸環境的變化可能影響抗氧化物質的結構和相互作用。有研究報道FRAP和ABTS抗氧化活性與酚類物質含量呈正相關[39]。本研究中，荷葉富含酚類物質，且具有較好的FRAP鐵離子還原能力和ABTS自由基清除能力等抗氧化活性。熱處理方式不僅影響荷葉中總酚及總黃酮釋放量，對荷葉的FRAP抗氧化能力及ABTS抗氧化能力也有一定影響。其中微波真空處理效果最好，荷葉直徑越大其FRAP抗氧化能力及ABTS抗氧化能力越高，這與熱處理方式對荷葉中總酚、總黃酮釋放量影響規律一致。

4 結論

熱處理方式和消化方式均會影響不同生長期荷葉總酚和總黃酮釋放量及其FRAP、ABTS抗氧化活性。相同處理條件下，直徑越大，其酚類含量釋放量越高，抗氧化活性越強。此外，相同消化方式不同熱處理下，真空微波處理組中荷葉的酚類含量和抗氧化活性與濕熱蒸汽和煮沸處理組相比均較高。在相同熱處理不同消化方式下，模擬腸液消化能顯著提高真空微波、濕熱蒸汽和煮沸處理組中荷葉酚類含量和抗氧化活性，且真空微波處理組中荷葉的酚類釋放量與其抗氧化活性在模擬胃液和腸液消化中均高于濕熱蒸汽和煮沸處理組。綜上所述，真空微波V56組顯著提高了荷葉中酚類物質的釋放量以及其抗氧化活性。因此熱處理對于荷葉中酚類物質的釋放及其抗氧化活性的提高具有積極影響，這為今后荷葉食品的開發與利用提供了理論基礎。