微小RNA-122降低乳腺癌細胞Warburg效應抑制其增殖、侵襲的作用機制研究

王瑾 楊毅 盛泳佳 李文燕 韓晨陽

近幾年來研究表明，腫瘤為了逃避代謝壓力，發生了轉移，這個過程需要能量支持，同時伴隨著物質代謝[1-3]。正常細胞的能量代謝以有氧糖代謝為主，而腫瘤細胞以無氧糖酵解的代謝方式為主，這種代謝方式可以使得腫瘤獲得更高的侵襲能力，逃避正常的細胞凋亡程序。正常細胞中糖類代謝的主要方式是有氧代謝，在缺氧條件下則發生糖酵解，產生乳酸[4-5]。研究證實，腫瘤細胞即使在有氧環境中依然進行無氧糖酵解，而不經過線粒體的氧化磷酸化過程[6]，因此調控腫瘤物質能量代謝成了腫瘤治療新的方向。

微小 RNA-122（microRNA，miRNA）是一種＜20nt的非編碼RNA，可以結合到mRNA編碼區，影響蛋白質合成，在細胞生理和病理過程中發揮著重要的調控作用。乳腺癌存在多種miRNA的異常表達，其中miRNA-122在乳腺癌中呈低表達。研究表明，miRNA-122在乳腺癌中的表達水平直接影響到腫瘤患者的預后，但是miRNA-122低表達的調控原因不明，其作用機制也尚未明確[7-8]。課題組前期研究發現，miRNA-122是M型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M，PKM）和檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）的調控非編碼RNA。PKM和CS是糖代謝的關鍵酶，其表達水平可以影響糖酵解過程，尤其是PKM表達增高可以促進腫瘤細胞對于葡萄糖的攝取和利用，提高其代謝水平。本研究擬以人乳腺癌細胞為對象，從能量代謝的角度探討miRNA-122抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑 人乳腺癌細胞株MCF-7、DMEM高糖培養基購于武漢普諾賽生命科技有限公司（批號：CL-0149、158758）。miRNA-122 mimic 購于德國 QiAGEN公司（批號：Q1854241）；cDNA試劑盒購于凱基生物技術有限公司（批號：KGA1311）；實時定量PCR試劑盒/SYBR Green Real time PCR Master Mix購于Sinobio公司（批號：E090）；總 RNA 提取試劑盒（Trizol法）購于BioTeKe公司（批號：RP2041）；雙熒光素酶檢測試劑盒、T4 DNA連接酶和感受態大腸桿菌DH5α購于Promega公司（批號：A18243654、M1794185、D1814522）；Opti-MEM無血清培養基購于Gibco公司（批號：15685）；CCK-8檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司（批號：C0037）；PKM和CS單克隆抗體購于Cell signaling technology公司（批號：3827、14309）；GOD-POD 法葡萄糖檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒（乳酸脫氫酶法）購于北京雷根生物技術有限公司（批號：TC0711、TC0731）。

1.2 方法

1.2.1 熒光素酶報告基因驗證miRNA-122和PKM、CS的調控關系 設計野生型PKM的3′非翻譯區（untranslated region，UTR）片段，序列為 3′-CUGUCCUHCAGCAAACACUCCA-5′，突變型序列為 3′-CUGUCCUGCAGCAACCUCACAC-5′。野生型CS的3′UTR片段序列為3′-GAAAGGAUUAAGAUACAACUCCU-5'，突變型序列為3'-GAAAGGAUUAAGAUCUACGACU-5′。序列設計合成由吉瑪生物公司完成，并進行質粒的構建，試驗所用的質粒為實驗室原有。PCR擴增條件為：反應體系50μl，95℃預熱 4min，95℃變性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 90s，5 個循環；95℃變性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸90s，25個循環；72℃延伸10min，4℃保存。將切膠回收的產物和載體酶切，T4 DNA連接酶線性化后與CD163 3′UTR片段連接，取連接產物轉化至感受態大腸桿菌DH5α篩選陽性克隆。將miRNA-122轉染后，PBS洗滌1次，加入裂解緩沖液后劇烈震蕩15min，然后移入1.5ml離心管，10 000r/min 離心 1min 后，取上清液 20μl加入96孔板，采用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性。

1.2.2 細胞分組及 miRNA-122 類似物（mimic）轉染MCF-7細胞體外采用DMEM高糖培養基培養，待細胞長至對數期后消化，將細胞分為Con組和miRNA-122組，Con組為未行miRNA-122轉染的細胞；miRNA-122組進行mimic的轉染。將mimic加入用DEPC處理的雙蒸水，稀釋濃度為100nmol/μl，將細胞接種至培養皿中，調節細胞濃度為7×105/ml，每孔體積1ml。細胞貼壁后進行轉染，500μl的 opti-MEM 培養基中加入 20μl的mimic溶液，將細胞培養基更換成混合了mimic的無血清DMEM培養基。轉染后12h棄去培養基，更換成DMEM完全培養基過夜培養。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期 Con組和miRNA-122組細胞接種在6孔板中貼壁培養24h，之后棄去培養基，加入500μl胰蛋白酶消化細胞，以PBS洗滌2～3次后，3 000r/min離心10min，收集細胞，加入 PI染液50μl，避光染色15min，洗去染液后上機檢測。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力 將Con組和miRNA-122組細胞接種到96孔板中，設置3組平行對照，待細胞貼壁后繼續培養6、12、24、48h后檢測細胞活力。棄去每孔的培養基后加入新鮮培養基100μl，同時加入10μl的CCK-8溶液繼續孵育4h。輕輕搖勻培養板后，在450nm處檢測OD值，同時設置空白培養基為空白對照。細胞增殖能力（%）=（OD實驗組-OD空白對照）/OD空白對照×100%。

1.2.5 克隆形成實驗 收集Con組和miRNA-122組細胞，調整細胞濃度為500～1 000個/孔，接種到6孔板中，每組設置3個復孔，同時采用含有30%FBS的DMEM培養基培養，每隔3d觀察細胞狀態。待細胞形成克隆后（2周時間），棄去培養基，PBS清洗2次后加入多聚甲醛固定，每孔加入結晶紫染色液1ml，搖勻后染色2min，棄去染色液后雙蒸水洗2～3次，拍照后計算克隆形成數。

1.2.6 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 Con組

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光素酶報告基因驗證 miRNA-122與 CS及PKM的靶向關系 空載體轉染后，對熒光素酶活性無影響。miRNA-122轉染后，miRNA-122組細胞中野生型 PKM 熒光素酶活性為（4.52±0.85），突變型 PKM 熒光素酶活性為（8.35±0.95），突變型 PKM 熒光素酶活性明顯高于野生型，差異均有統計學意義（均P＜0.05)；miRNA-122組細胞中野生型CS熒光素酶活性為（3.57±0.35），突變型 CS 熒光素酶活性為（8.75±0.67），突變型CS熒光素酶活性明顯高于野生型，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。Con組細胞中野生型PKM熒光素酶活性為（8.13±0.87），突變型 PKM 熒光素酶活性為（8.39±0.65），差異無統計學意義（P ＞0.05）；野生型 CS 的熒光素酶活性為（8.05±0.74），突變型 CS 熒光素酶活性為（8.32±2.35），差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖 1。和miRNA-122組細胞加入Transwell小室，待細胞貼壁后，上室用無血清的DMEM培養基培養，下室加入10%FBS的DMEM完全培養基培養，培養24h后取出小室，棄去培養基，甲醇固定后用0.1%的結晶紫染色，棉簽擦去上層未遷移的細胞后，鏡下計算遷移的細胞數。

1.2.7 Western blot檢測糖代謝關鍵酶 HK、PKM、CS 的表達水平 Con組和miRNA-122組細胞培養48h后，棄去培養基，收集細胞，PBS洗滌2次，加入RIPA蛋白裂解液冰上裂解細胞30min，離心后取上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度，經過SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗孵育過夜后以TBST漂洗，加入IgG-HRP二抗孵育，ECL顯色液顯色后，成像系統成像，條帶采用凝膠定量分析軟件Quantity One 4.4處理后，以GAPDH為內參校正。

1.2.8 葡萄糖消耗量及乳酸水平的檢測 細胞培養前，按照說明書操作檢測MCF-7培養基以及DMEM高糖培養基中葡萄糖濃度，結果以mmol/L為單位表示，換算后作為初始葡萄糖含量A（mmol）。將Con組和miRNA-122組細胞接種到6孔板后，設置3組平行孔，待細胞貼壁后繼續培養48h后，參照說明書操作再次檢測葡萄糖含量，結果為A1（mmol），細胞對于葡萄糖的消耗量（mmol/h）=（A-A1）/48h。乳酸水平的檢測采用試劑盒進行，最終乳酸水平以mmol/L為單位表示。

圖1 熒光素酶報告基因實驗結果（與Con組比較，*P＜0.05）

2.2 兩組細胞的細胞周期檢測結果比較 miRNA-122組細胞中S期和G1/G0期細胞比例高于Con組，差異有統計學意義（P＜0.05），而G2期細胞比例與Con組比較無統計學差異（P＞0.05）。細胞周期檢測提示，miRNA-122組中細胞周期阻滯在G0/G1期，見圖2-3。

圖2 流式細胞術檢測細胞周期（a：Con組；b：miRNA-122組）

圖3 兩組細胞的細胞周期分布比較（與Con組比較，*P＜0.05）

2.3 兩組細胞增殖能力比較 miRNA-122轉染后6、12、24、48h，CCK-8 檢測顯示，miRNA-122 組細胞增殖能力顯著低于Con組，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明miRNA-122類似物可以抑制細胞的增殖，見圖4。

2.4 兩組細胞克隆實驗結果形成比較 在克隆實驗的2 周內，Con 組細胞形成的克隆數為（58.65±8.15）個，顯著高于 miRNA-122 組的（19.35±3.58）個，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 5（見插頁）。

2.5 各組細胞侵襲能力比較 Con組和miRNA-122組細胞均具有侵襲能力，在同一條件下培養24h后，Con組侵襲細胞（112.55±19.32）個，而 miRNA-122 組為（65.85±19.36）個，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6（見插頁）。

圖4 細胞增殖能力的檢測結果（與Con組比較，*P＜0.05）

圖5 克隆形成實驗（A：Con組；B：miRNA-122組；結晶紫染色）

圖6 細胞侵襲實驗結果（a：Con組；b：miRNA-122組；結晶紫染色，×200）

2.6 各組細胞糖酵解關鍵酶HK、PKM、CS的蛋白表達比較 Con組細胞中糖酵解關鍵酶HK、PKM和CS的蛋白水平顯著低于miRNA-122組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），說明細胞糖酵解被抑制，見圖7。

2.7 兩組細胞葡萄糖利用率和乳酸水平比較 培養48h后，Con組中葡萄糖的消耗水平顯著高于miRNA-122組，而乳酸的產生水平也顯著高于miRNA-122組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖8。

圖7 兩組細胞糖酵解關鍵酶的表達比較（a：蛋白電泳條帶圖；b：蛋白相對表達量統計柱狀圖；與Con組比較，*P＜0.05）

圖8 細胞葡萄糖利用率和乳酸水平（a：葡萄糖消耗水平；b：乳酸產生水平；與Con組比較，*P＜0.05）

3 討論

腫瘤細胞的能量代謝不同于正常細胞，1930年Warburg就發現腫瘤細胞中糖代謝的主要方式是無氧糖酵解，這種代謝方式不依賴于環境，稱為Warburg效應。相比有氧代謝，糖酵解能夠消耗更多的葡萄糖，產生乳酸，有利于維持腫瘤微環境。研究發現，絕大多數實體腫瘤中都存在代謝異常，Warburg效應廣泛存在[9-10]。腫瘤細胞葡萄糖有氧代謝減少后，丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）等的高表達可以進一步促進糖酵解的發生，而糖酵解作為腫瘤糖代謝的主要方式，可以產生三磷酸腺苷（adenosine triphophate，ATP）提供能量，也可以維持腫瘤微環境的乳酸供給，從而提高了腫瘤細胞抗凋亡能力，也為延長腫瘤細胞生存期提供了物質和能量的保證[11-12]。乳腺癌是一種轉移能力較高的惡性腫瘤，隨著病情的發展，往往會發生骨轉移、肺轉移、腦轉移等[13]，轉移過程中需要大量的能量供給，所以乳腺癌細胞的代謝異常旺盛，這種代謝能力也和Warburg效應直接相關。

miRNA能結合到mRNA 3′UTR區，導致mRNA降解或翻譯受阻，從而下調靶基因的表達。miRNA表達失調與腫瘤的發生、進展和轉移等有著密切聯系，外周血液循環中的miRNA可作為腫瘤診斷和預后的分子標志之一。miRNA可通過小囊泡作為載體（如：外泌體exosomes）分泌到細胞外微環境中。越來越多的證據表明，miRNA能夠通過這些小囊泡被轉運到鄰近或遠處的細胞中，參與細胞功能調節[14]。研究發現，miR-122能調節細胞膽固醇外流、肝臟甘油三酯含量及β氧化率，PKM是miR-122潛在的靶基因之一[15-16]。由于脂代謝和糖代謝密切相關，以往的研究已經證實miRNA-122與脂代謝的關系，而miRNA-122也是PKM的重要調控非編碼RNA之一，因此在脂代謝和糖代謝中miRNA-122可能都有一定的作用，除了可以調節脂的代謝水平外，也可以降低糖代謝的水平[17]。研究已經發現，在乳腺癌細胞中miRNA-122低表達，而外周血中miRNA-122表達增高，這提示miRNA-122可能通過細胞外分泌的方式產生生物學效應，但是miRNA-122是否影響乳腺癌細胞糖代謝還需要進一步深入的研究[18-19]。

本研究采用熒光素酶報告基因法證實了miRNA-122是PKM和CS的調控基因，miRNA-122可以抑制PKM和CS翻譯過程。而PKM和CS是糖酵解的關鍵酶，對于葡萄糖轉化成乳酸的關鍵環節具有調控作用。后續實驗中也發現，miRNA-122類似物轉染后，糖酵解相關的酶活性受到抑制，葡萄糖利用率下降，乳酸水平也下降，這表明，miRNA-122抑制了細胞的Warburg效應，降低了乳酸的產生。同時細胞周期發生阻滯，細胞增殖率也下調，細胞克隆形成能力和侵襲能力也減弱，筆者認為這也是因為細胞能量供應不足所致[20]。綜合上述實驗結果，筆者得出結論，miRNA-122可以通過靶向抑制PKM和CS基因表達，抑制蛋白質的翻譯，同時抑制了細胞Warburg效應，降低乳腺癌細胞轉移侵襲的能力。

綜上所述，本研究發現miRNA-122可以通過調節乳腺癌細胞Warburg效應，抑制乳腺癌細胞轉移和侵襲，這是miRNA-122在腫瘤細胞內的作用，而在細胞外和細胞間信息傳遞和功能依舊需要進一步深入研究。