糞腸球菌對利奈唑胺低水平耐藥機制的研究及同源性分析

陳喆 張青 錢定良 蘇海珍 李向陽

腸球菌為革蘭陽性球菌，廣泛分布于人和動物消化道及女性生殖道內，是重要的條件致病菌，多見于醫院感染。由于其固有耐藥和獲得性耐藥的雙重特性，以及各類抗生素廣泛應用造成的高選擇性壓力，導致多重耐藥（multiple drug resistance，MDR）腸球菌逐漸增多，甚至出現耐萬古霉素腸球菌（vancomycin-resistantenterococci，VRE）。利奈唑胺是一種人工合成的吧惡唑烷酮類抗菌藥物，通過與細菌核糖體50S亞基結合抑制轉錄的初

始步驟起抑菌作用，對革蘭陽性菌，包括耐青霉素的肺炎鏈球菌、耐甲氧西林的葡萄球菌和耐萬古霉素的腸球菌均有良好的抗菌作用。隨著利奈唑胺在臨床上的使用，陸續出現了耐藥菌株的報道[1-3]，根據近年衛生部全國細菌耐藥監測網的監測報告顯示臨床上最常分離的耐藥細菌為腸球菌。已知耐利奈唑胺腸球菌的耐藥機制包括23S rRNA基因V區以及編碼核糖體蛋白L3、L4的基因突變和由攜帶多重耐藥基因cfr介導耐藥，近年又發現新型耐藥基因optrA。本文對近年臨床分離的4株利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌的耐藥機制及其同源性進行探討，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集 2016年1月至 2017年12月溫州醫科大學附屬第三醫院臨床分離非重復腸球菌感染標本1 170份（糞腸球菌568株，屎腸球菌538株，其他腸球菌64株），全部菌株經Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定系統配套的鑒定卡（GP）和藥物敏感試驗卡（GP-68）行菌株鑒定及體外藥物敏感性試驗。分離出耐藥菌株4株（E01-E04），均為糞腸球菌，采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）再次鑒定，并采用微量肉湯稀釋法確認利奈唑胺最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。質控菌株為糞腸球菌ATCC29212，cfr基因陽性對照菌株為本實驗室頭狀葡萄球菌，體外藥物敏感性試驗結果根據2017年美國臨床實驗室標準化協會（the clinical and laboratory standards institute，CLSI）標準判讀。利奈唑胺的判讀標準為：敏感（S）為 MIC≤2μg/ml，中介（I）為 MIC=4μg/ml，耐藥（R）為 MIC≥8μg/ml。4株菌株標本類型分別為膿液、創面、尿液、腹水；分別來自普外科、燒傷修復科、泌尿外科和婦科。

1.2 主要試劑及儀器 Vetik 2 Compact全自動微生物分析系統、GP鑒定卡、GP-68藥敏鑒定卡、MALDITOF-MS質譜儀（法國bioMerieux公司）；LB液體培養、哥倫比亞血瓊脂平板（英國Oxoid公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；PCR擴增試劑、DNA Marker（DL2000）（上海生工生物工程公司）；PCR擴增儀、水平電泳槽、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；50*TAE緩沖液、瓊脂糖粉末、gold view核酸染料（上海賽百威基因技術有限公司）。

1.3 細菌基因組提取 將冷凍干燥保存的腸球菌復蘇并接種至哥倫比亞血瓊脂平板，35℃培養24h后，再將腸球菌接種LB液體培養基進行過夜增菌，12～16h后根據北京天根生化科技有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取糞腸球菌基因組DNA模板。

1.4 PCR擴增 23S rRNA V區基因、核糖體蛋白L3和L4編碼基因（rplC、rplD）及多重耐藥基因cfr和optrA的引物由上海生工生物工程公司合成，具體引物序列見表1。PCR 體系為：DNA 模板 2μl，上、下游引物各 1μl，PCR Mix（2*）25μl，加滅菌雙蒸水至 50μl。

表1 PCR引物序列

取5μl PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統觀察，剩余陽性擴增產物送上海生工生物工程公司雙向測序拼接，測序合格的結果通過NCBI GeneBank（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）與野生菌株數據庫進行序列比對分析，確定糞腸球菌23S rRNA V區基因、L3和L4編碼基因是否存在突變位點及是否存在cfr和optrA耐藥基因。

1.5 多位點序列分型MLST 糞腸球菌MLST的7個管家基因（gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yiql）引物序列和擴增條件參照糞腸球菌數據庫（http://efaecalis.mlst.net/misc/info.asp）設計，由上海生工生物工程公司合成引物。反應體系同前。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后送上海生工生物工程公司測序，使用BioEdit軟件（Version7.0.9.1）處理測序結果，最后將測序結果錄入PubMLST比對，從而確定其ST型。將本研究獲得的等位基因序列數據使用eBURST軟件（Version 3，http://eburst.mlst.net/）進行親緣關系分析。

2 結果

2.1 藥敏結果 4株糞腸球菌均表現為MDR，即對超過3種或3種以上抗菌藥物耐藥，對呋喃妥因、萬古霉素及替加環素均敏感，而對四環素、喹奴普汀/達福普汀、利奈唑胺均耐藥。微量肉湯稀釋法檢測法顯示4株對利奈唑胺的MIC均為8μg/ml，呈低水平耐藥。

2.2 突變位點及多重耐藥基因cfr和optrA的PCR測序結果 4株糞腸球菌的23S rRNA V區基因、核糖體蛋白L3和L4編碼基因均未發現任何位點突變（比對野生菌株GenBank CP033787），均未擴增出cfr基因，但optrA基因均擴增出陽性產物，且條帶大小與目的基因相符，經測序比對4株均攜帶optrA基因，見圖1。本研究進一步擴增同期分離且對利奈唑胺敏感的10株糞腸球菌和標準株（ATCC 29212）是否攜帶多重耐藥基因cfr和optrA。結果顯示，10株臨床分離的利奈唑胺敏感糞腸球菌和標準株（ATCC29212）均未攜帶cfr和optrA基因。

圖1 4株利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌optrA基因電泳圖（Marker：DL2000 Marker；N：陰性對照；E01-E04：4 株利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌）

2.3 MLST分析 4株利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌屬于 4個 ST 型，分別為 ST476、ST16、ST116、ST75。4株菌株再與MLST數據庫中972株糞腸球菌比較，發現第二大克隆群是ST16克隆復合體。本實驗1株ST16、1株ST116和1株ST75屬于3個不同的ST克隆群，而1株ST476為單獨的ST型，見圖2。

圖2 MLST數據庫中972株糞腸球菌的種群快照圖

3 討論

本研究共分離鑒定出腸球菌1 170株，其中利奈唑胺耐藥腸球菌4株，均為糞腸球菌。糞腸球菌和屎腸球菌對利奈唑胺的耐藥率分別為0.7%和0.0%，稍低于衛生部全國細菌耐藥監測網的監測報告（糞腸球菌和屎腸球菌對利奈唑胺的耐藥率為1.2%和0.2%）。

腸球菌對利奈唑胺的主要耐藥機制可以分為兩大類：非轉移性耐藥（23S rRNA V區突變和核糖體蛋白L3、L4突變）和轉移性耐藥（多重耐藥基因cfr和新型耐藥基因optrA）。利奈唑胺是通過結合核糖體肽基轉移酶活性中心（peptidyl transferase center，PTC）的 A 位點發揮作用。A位點位于核糖體催化功能核心23S rRNA的V區，由此23S rRNA V區突變是目前已知最主要的耐藥機制，最常見的突變位點為G2576T[6]。核糖體蛋白L3大部分位于核糖體50S亞基的表面，有一個環狀的尾部延伸至肽基轉運中心（PTC），L3的點突變（如F147L和A157R）可導致利奈唑胺MIC值的上升。核糖體蛋白L4也位于與PTC距離很近的區域。cfr基因編碼一種甲基轉移酶，這種酶能夠修飾細菌23S rRNA（在A2503的位置，導致轉錄后的甲基化）并且導致對多種抗菌藥物（如利膽醇、林肯酰胺、吧惡唑烷酮類、鏈酶殺陽菌素A）產生耐藥。cfr基因大多以質粒作為載體，2004—2012年的全球多中心監測研究 ZAAPS顯示該耐藥機制在利奈唑胺耐藥腸球菌中很少見[8]，多見于利奈唑胺耐藥葡萄球菌。本研究對上述耐藥機制進行了初步研究，均未檢測到23S rRNA V區、核糖體蛋白L3和L4編碼基因任何位點突變，cfr基因也顯示為陰性，因此初步推斷4株利奈唑胺低水平耐藥與新發現的optrA基因有關。

optrA基因于2015年由Wang等[7]首次在中國動物源和人源分離的腸球菌中發現，該基因既可以存在于染色體上，也可存在于質粒上，是繼cfr之后報道的第2個可轉移性耐藥基因。其編碼一種ABC轉運蛋白，屬于ABC家族，該家族是細菌中存在的一種外排裝置，可介導腸球菌對吧惡唑烷酮類和利膽醇類抗生素的耐藥性，還可以介導金黃色葡萄球菌對氯霉素類的耐藥性[7]。有研究顯示76.5%optrA基因陽性菌株對利奈唑胺非敏感，MIC為4～8μg/ml，大多數optrA基因陽性菌的cfr基因檢測結果為陰性[9-11]。本文顯示4株利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌均攜帶optrA基因，MIC為8μg/ml，且cfr基因陰性，與研究相符。在中國的21個省市29家醫院監測到2004—2014年optrA基因陽性的腸球菌已經從0.4%上升到3.9%，且在糞腸球菌中比屎腸球菌中常見（3.7%vs0.5%）[12]。本研究的4株optrA陽性利奈唑胺耐藥糞腸球菌為浙江瑞安地區首次報道。除外中國，在美國、意大利也發現了攜帶optrA基因的腸球菌[13-14]。

根據MLST分型結果和菌株分離科室等相關信息，推測利奈唑胺耐藥糞腸球菌菌株在本院呈散發，本院發現的 4 個 ST 型，分別為 ST476、ST16、ST116、ST75，其中ST16型和ST476型亦有報道見于浙江、廣東和河南的醫院[10]。

綜上所述，本研究初步推斷攜帶optrA基因與糞腸球菌對利奈唑胺呈現低水平耐藥有關，可進一步研究optrA基因的定位和遺傳背景，該基因的出現已經引起了國內外相關學者的關注，因此應做好利奈唑胺耐藥菌的相關實驗室檢測和流行病學監測，防止該類菌在醫院環境中的播散和流行。