肺炎克雷伯菌致肝膿腫的臨床和微生物學特征分析

林超 董郭楓 張思琴 田學斌 周翠 張秀彩 張藝之 曹建明 周鐵麗

肺炎克雷伯菌作為腸桿菌科的成員之一，是引起社區和醫院獲得性感染不可忽視的潛在病原體，目前已成為僅次于大腸埃希菌的第二大條件致病菌，可使免疫功能受損的患者發生肺炎、尿路感染、菌血癥和腦膜炎等多種感染[1]。在過去的20年中，在健康和免疫力低下的人群中出現了一種與普通肺炎克雷伯菌不同的肺炎克雷伯菌，即伴有高黏表型的新高毒力肺炎克雷伯菌[2]，可使健康的年輕個體發生肝膿腫等侵襲性感染，并可從原發感染部位播散侵襲到其他器官，一旦發生侵襲性播散，患者常伴有嚴重且不可逆的難治性后遺癥[2-3]。據統計，由肺炎克雷伯菌所致的細菌性肝膿腫占肝膿腫的43%～66%[4]，患者常表現為發熱、寒戰、肝腫大及肝區疼痛等全身膿毒性反應，還可出現肝外侵襲綜合征，甚至并發血流感染。肝膿腫患者的中毒癥狀嚴重，若膿腫引流不徹底，抗菌藥物使用不及時，患者通常難以治愈[3]，嚴重威脅患者的健康甚至生命，因此臨床工作者應高度重視。目前，肺炎克雷伯菌發揮致病性的主要毒力因子為莢膜、脂多糖和鐵載體[5]。其中，K1和K2血清型是高毒力肺炎克雷伯菌最常見的莢膜血清型，類黏蛋白表型調節基因A（rmpA）是激活莢膜生成，導致菌株產生高黏表型且毒力增強的重要調節因子[6]，氣桿菌素鐵載體是肺炎克雷伯菌毒力增強的重要因素[7]。本研究回顧性分析163例肺炎克雷伯菌肝膿腫患者的臨床特征，并探討肺炎克雷伯菌的的微生物學特征，旨在為臨床肝膿腫的診治提供依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料 回顧2016年1月至2017年12月溫州醫科大學附屬第一醫院收治的163例肺炎克雷伯菌肝膿腫患者的臨床資料。細菌性肝膿腫診斷標準：具有臨床特征（發熱、寒戰、腹痛、腹脹等），影像學（B超或CT）檢查結果符合肝膿腫影像學特征，微生物培養（膿液或血液）結果證實病原菌為肺炎克雷伯菌。根據中華人民共和國衛生部《醫院感染診斷標準（試行）》[8]判斷感染類型：無明確潛伏期的感染，入院48h后發生的感染為醫院感染，48h以內發生的感染為社區感染。肝膿腫治療療效判斷標準[9]：臨床癥狀、體征消失，膿腫縮小≥50%為顯著有效；臨床癥狀、體征改善，膿腫縮?。?0%為有效；臨床癥狀、體征無改善，膿腫無縮小為治療無效。

1.2 菌株鑒定 對分離出的163株肺炎克雷伯菌臨床菌株（已剔除同一患者相同部位重復分離的菌株）分別接種到哥倫比亞血瓊脂平板，在37℃培養箱中孵育18～24h；挑取單個純菌落，在無菌機用生理鹽水中調成0.5 麥氏單位（約 1.5×108CFU/ml）濁度的細菌懸液，采用VITEK 2型全自動微生物分析儀對其進行鑒定確認。

1.3 拉絲試驗 將分離出的163株肺炎克雷伯菌臨床菌株接種至哥倫比亞血瓊脂平板，置37℃培養箱中孵育18～24h，用接種環在單個菌落表面輕輕接觸并向側面牽拉，如黏液絲形成且長度＞0.5cm，判斷為陽性[10]。

1.4 藥敏試驗 將分離出的163株肺炎克雷伯菌臨床菌株分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板，在37℃培養箱孵育18～24h；挑取單個純菌落，在無菌機用生理鹽水中調至 0.5 麥氏單位濁度（約 1.5×108CFU/ml）的菌懸液，加菌懸液至藥敏檢測卡，隨后于VITEK 2型微生物分析儀上機分析，從而獲得肺炎克雷伯菌對臨床常用抗菌藥物的藥敏結果，藥敏試驗結果參照美國臨床實驗室標準化協會CLSI 2017標準[11]進行判讀。

1.5 毒力基因和莢膜血清型檢測 采用PCR擴增法檢測細菌毒力基因和莢膜血清型。將已培養好的肺炎克雷伯菌置于裝有400μl去離子水的離心管中，100℃加熱15min，然后冰浴 10min，再 12 000g離心 5min，最后提取肺炎克雷伯菌DNA模板。PCR擴增毒力基因rmpA和氣桿菌素，血清型 K1、K2、K5、K20、K54、K57。引物參照文獻[12-13] 合成，見表1。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色后凝膠成像觀察結果，陽性產物送至華大基因公司測序，序列經Blast和NCBI數據庫進行比對確認。

表1 毒力基因和莢膜血清型引物序列

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計數資料以頻數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 163例肝膿腫患者的一般資料和臨床特征 肺炎克雷伯菌引起的肝膿腫主要見于50歲以上的中老年患者，88.9%的患者具有發熱癥狀，49.7%的患者伴有糖尿病，見表2。

表2 163例肝膿腫患者的一般資料及臨床表現[例（%）]

2.2 拉絲試驗結果 結果顯示，163株肺炎克雷伯菌中50株菌株為陽性，提示具有高黏表型。

2.3 兩種類型肺炎克雷伯菌的耐藥情況 對臨床常用的抗菌藥物（哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢他啶、頭孢替坦、亞胺培南、厄他培南、頭孢曲松、頭孢吡肟、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明），50株高黏表型肺炎克雷伯菌菌株中的耐藥率均＜7%，113株非高黏表型肺炎克雷伯菌菌株的耐藥率均＜13%，見表3。

表3 兩種類型肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥情況[株（%）]

2.4 兩種類型肺炎克雷伯菌毒力基因和血清型分布情況 具有高黏表型的50株肺炎克雷伯菌均攜帶rmpA基因，攜帶率為100%，44株攜帶氣桿菌素，占88.0%（44/50）；K1、K2、K5、K20 血清型分別為 18 株、19 株、3株和1株，其中9株未分型，未檢到K54、K57血清型（圖1）。非高黏表型菌株毒力基因rmpA和氣桿菌素的檢出率分別為92.9%和84.1%。高黏表型肺炎克雷伯菌K2型顯著多于非高黏表型菌株，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組菌株毒力基因攜帶率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 4。

圖1 毒力基因及莢膜血清型分型電泳結果（M：Marker；N：陰性對照）

2.5 不同毒力基因、莢膜血清型、治療方法患者的預后情況 163例肺炎克雷伯菌致肝膿腫患者中經治療后好轉116例，治療無效47例。兩組患者間毒力基因和莢膜血清型攜帶差異均無統計學意義（均P＞0.05），但采取引流的患者治療好轉率顯著高于未引流患者（P＜0.05）。見表5。

表4 兩種類型肺炎克雷伯菌毒力基因和莢膜血清型分布情況[株（%）]

3 討論

肝膿腫為臨床常見的疾病，其主要的臨床癥狀為發熱、寒戰、腹痛、惡心及嘔吐等全身膿毒性反應，均為非特異性癥狀。有研究表明，肺炎克雷伯菌為肝膿腫的主要致病菌[3]，且肺炎克雷伯菌引起的肝膿腫常見于60～70歲患者[14]。本研究結果顯示，肺炎克雷伯菌引起的肝膿腫主要見于50歲以上患者，其中46%的患者年齡≥65 歲；88.9%的患者伴有發熱，81.0%的患者伴有畏寒、寒戰，與文獻報道基本一致。這些癥狀出現的時間較早，但由于其為非特異性癥狀，不能及時診斷為肝膿腫，導致無法盡早治療，從而影響患者康復。同時，本研究中49.7%的患者具有糖尿病基礎疾病，分析原因可能是糖尿病患者的免疫功能相對較差，使病原菌更易入侵機體，對病原菌的抵抗力也相對較弱。

有研究表明，肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的耐藥率呈現上升趨勢[15]。本研究發現肝膿腫肺炎克雷伯菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率較低，但長期以來，碳青霉烯類藥物作為治療肺炎克雷伯菌感染有效的抗菌藥物之一，近年來耐藥菌株開始出現，導致碳青霉烯類藥物的治療效果有所減弱，在本研究中分離自肝膿腫肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率為3%，提示我們需關注高毒力且耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的傳播，以免給臨床治療帶來更大的困難。

有研究顯示高毒力菌株內rmpA基因的攜帶率接近100%[16]，證明rmpA與高毒力肺炎克雷伯菌具有顯著的相關性。同時，氣桿菌素是肺炎克雷伯菌鐵載體中最重要的鐵載體系統[17]，是肺炎克雷伯菌毒力增加的重要因素。因此攜帶rmpA和氣桿菌素的肺炎克雷伯菌通常具有高毒力。目前，肺炎克雷伯菌中K1和K2是高毒力肺炎克雷伯菌最常見的莢膜血清型[13]。本研究中高黏表型菌株與非高黏表型菌株毒力基因rmpA和氣桿菌素攜帶率無明顯差異，rmpA攜帶率均＞90%，氣桿菌素攜帶率均＞80%；高黏表型菌株K1莢膜血清型分布顯著少于非高黏表型菌株（P＜0.05），高黏表型菌株血清型均以K1和K2型常見，非高黏表型菌株血清型以K1型常見?；谝陨辖Y果，筆者發現不論是否具有高黏表型，這些肝膿腫肺炎克雷伯菌幾乎都具有高毒力，因此，筆者推測判斷高毒力菌株不能僅以高黏表型為判斷標準，現已有研究表明高黏表型與高毒力并不是完全相關，攜帶rmpA和氣桿菌素的菌株即使不具有高黏表型也具有高毒力[18]。因此，在臨床治療過程中不能因為患者感染的肺炎克雷伯菌為非高黏表型菌株而認為其毒力較低而輕視這些患者的治療，需結合臨床癥狀及時對患者進行有效治療。

本研究中163例患者均進行了抗菌藥物治療，其中進行引流治療135例，未進行引流治療28例，經引流治療的患者好轉率明顯高于未進行引流治療的患者（P＜0.05），因此，可認為引流治療是肝膿腫治療的重要有效手段。筆者推測患者預后與患者基礎疾病、自身免疫力、所使用的抗菌藥物、是否引流等多種因素有關，其中引流是否及時是一個重要影響因素。

表5 不同毒力基因、莢膜血清型、治療方法患者的預后情況[株（%）]

綜上所述，肺炎克雷伯菌肝膿腫常見于中老年患者，對常用抗菌藥物的耐藥率低，但已出現多重耐藥菌株，需引起高度關注，防止多重耐藥的高毒力肺炎克雷伯菌的擴散；同時本研究發現菌株即使不具有高黏表型，但也可能具有高毒力；一旦發現肝膿腫患者，應密切關注其臨床表現，制定合理的治療方案，及時使用抗菌藥物和進行引流治療，從而提高患者的好轉率/治愈率。