中國荷斯坦牛TLR1基因SNPs快速篩查及蛋白功能預測

吳恩蕓 任穩(wěn)穩(wěn) 李耀東 劉麗霞 曹 忻 張 麗

(西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730124)

Toll樣受體(Toll like recepter,TLRs)是一類在生物進化中比較保守的模式識別受體，能在微生物病原體感染機體早期做出免疫應答，是機體天然免疫防御中的重要因子[1]，可直接識別病原體的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)進而啟動免疫應答并建立獲得性免疫[2]。研究表明，不同組織中，TLRs的表達水平直接影響其對入侵該組織的病原體的識別作用[1]。近年來，關于Toll樣受體的研究主要集中在TLR2基因和TLR4基因上，而對TLR1基因的研究相對較少。TLR1基因為TLRs基因家族中的一員，是中國荷斯坦牛的重要免疫基因之一，同時還被認為與中國荷斯坦牛乳房炎的易感性有密切的聯(lián)系[3]。陳亞冰等[1]研究發(fā)現(xiàn)TLR1基因能與TLR2基因形成異源二聚體，共同參與識別革蘭氏陽性菌和陰性菌的細胞壁，并可以增強對PAMPs的特異性識別。全基因組掃描發(fā)現(xiàn)位于6號染色體上的TLR6-TLR1-TLR10基因族有顯著影響泌乳性狀和臨床乳房炎的數(shù)量性狀位點[2]。李春苗等[4]研究表明，荷斯坦牛的TLR1基因具有豐富的多態(tài)性，且TLR1基因中的H等位基因具有作為荷斯坦牛乳房炎抗性遺傳標記的潛在有效性。Russell等[3]研究發(fā)現(xiàn)TLR1基因?qū)伤固古５娜榉垦椎陌l(fā)生具有顯著影響。

DNA池是將具有相同特征群體的個體DNA提取后按比例混合，再經(jīng)PCR擴增測序后可直接檢測出SNPs的一種方法[5]，具有成本低、效率高的優(yōu)點。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)是指染色體基因組中單個核苷酸的突變而引起的DNA序列的多態(tài)性，以單個堿基的顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等形式存在[6]，是基因組水平上最常見的一種遺傳變異類型[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物中平均每300 ～1 000 bp就有1個SNP位點[9]。作為第三代分子標記，SNP 標記具有較大的發(fā)展?jié)摿Γ壳耙呀?jīng)建立多種SNP檢測分型技術[10]，如DNA芯片技術、陣列雜交分析、同源雜交法、直接測序法等[8]，而理想的SNP分型方法應同時具備以下優(yōu)點：1)操作簡單，可實現(xiàn)自動化；2)通量靈活，可根據(jù)需要加以選擇；3)分析速度快，數(shù)據(jù)處理容易；4)適應性強，對樣本要求不高；5)結(jié)果可靠，費用可接受。然而，目前的檢測方法尚無法完全滿足上述要求[11]。初芹等[12]認為采用DNA池測序法篩選奶牛高信息量SNP標記是可行和可信的。利用DNA混合池和直接測序技術對未知SNPs或已知SNPs等位基因頻率進行快速篩查，可極大縮短試驗周期，達到顯著減少基因組DNA消耗的目的。DNA池進行直接測序時所要求的等位基因頻率最低為10%[13]。采用DNA池技術，方法簡便，效率較高，且有效結(jié)合了PCR的特點，使試驗能夠更加有效便利地進行。

本試驗以寧夏回族自治區(qū)的中國荷斯坦牛為研究對象，采用DNA池和直接測序法對中國荷斯坦牛TLR1基因SNPs進行篩選，并對其進行蛋白質(zhì)功能預測，以期明確TLR1基因?qū)χ袊伤固古Ｃ庖呒坝N方面的影響，為中國荷斯坦牛在分子遺傳相關方面的優(yōu)良育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

試驗動物：303頭中國荷斯坦牛，均來自寧夏賀蘭山奶業(yè)有限公司同一奶牛場，用醫(yī)用采血管從中國荷斯坦牛尾靜脈采血10 mL，20℃保存。采用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)從凍存中國荷斯坦牛血樣中提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，采用UV2100紫外分光光度計(廈門群創(chuàng)科技有限公司)檢測每個DNA 樣品濃度，加雙蒸水調(diào)整DNA樣品濃度至100 ng·μL-1，每45個樣品構建1個DNA池。

1.2 引物設計與PCR引物擴增

根據(jù)NCBI收錄的中國荷斯坦牛TLR1基因的DNA序列(NM_001046504)，使用Primer 6.0軟件設計9對特異性引物(表1)，由蘇州金唯智生物有限公司合成。PCR擴增的總體系為20 μL，包括上、下游引物各0.4 μL，蒸餾水7.4 μL，Taq PCR MasterMix 11.0 μL，DNA池模板0.8 μL。PCR擴增程序：95℃預變性3 min；35個循環(huán)×(95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s)；72℃終延伸10 min，4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠對擴增結(jié)果進行檢測。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

1.3 SNPs的篩選和等位基因頻率估算

將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后特異性良好的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒 (北京天根生化科技有限公司)純化后送至蘇州金唯智生物有限公司測序。測序結(jié)果使用BioEdit和MWSnap序列圖譜分析軟件標尺測量中國荷斯坦牛各突變位點的等位基因峰圖高度，按照公式估算各等位基因頻率：

(1)

式中，F(xiàn)i：某突變位點等位基因頻率(i=1,2)；h1、h2：測序峰圖中該突變位點等位基因1和2的峰高度。

1.4 生物信息學分析

參照文獻[14]對中國荷斯坦牛TLR1基因編碼區(qū)進行生物信息學分析，運用在線軟件AAcompldent(http://web.expasy.org/protparam/)對中國荷斯坦牛TLR1基因編碼的蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析，并對該基因編碼的蛋白質(zhì)進行疏水性和親水性的分析(http://web.expasy.org/protscale/)；運用在線分析軟件NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)對該基因編碼的蛋白質(zhì)進行N-糖基化位點分析；利用PredictProtein在線服務器預測TLR1蛋白二級結(jié)構；利用SWISS-MODEL同源建模方法構建TLR1蛋白三級結(jié)構模型，運用PyMOL 1.8.6軟件對突變前后蛋白三級結(jié)構進行對比并繪制結(jié)果視圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國荷斯坦牛TLR1基因DNA池PCR擴增結(jié)果

中國荷斯坦牛DNA樣品擴增結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性好，與預期目的片段大小一致。擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與NCBI中普通牛TLR1基因編碼區(qū)進行BLAST比對共發(fā)現(xiàn)8個SNPs，分別將其命名為A61T-TLR1、C632A-TLR1、C1408T-TLR1、C1451T-TLR1、A1461G-TLR1、A1475C-TLR1、G1550A-TLR1、G1596A-TLR1(圖1)，導致5個氨基酸發(fā)生改變(表2)。其中A61T-TLR1錯義突變使氨基酸由原來的賴氨酸(Lys)替換為甲硫氨酸(Met)；C632A-TLR1突變使苯丙氨酸(Phe)變?yōu)榱涟彼?Leu)；C1408T-TLR1突變使丙氨酸(Ala)替換為纈氨酸(Val)；A1461G-TLR1突變使異亮氨酸(Ile)轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(Val)；G1596A-TLR1突變使纈氨酸(Val)轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼?Ile)。

圖1 中國荷斯坦牛TLR1基因編碼區(qū)測序結(jié)果Fig.1 Sequencing of TLR1 coding region of Chinese Holstein cattle

2.2 SNPs篩查及等位基因頻率估算

由表2可知，C632A-TLR1、C1451T-TLR1、A1461G-TLR1、A1475C-TLR1和G1596A-TLRTLR15個SNPs位點的等位基因頻率在突變前后差值分別為0.190 4、0.130 4、0.117 6、0.136 4、0.181 8，而其他SNPs突變前后等位基因頻率的差值分別為0.555 6、0.416 6、0.481 4。前后兩組數(shù)據(jù)進行對比發(fā)現(xiàn)C632A-TLR1、C1451T-TLR1、A1461G-TLR1、A1475C-TLR1和G1596A-TLR15個SNPs位點的等位基因頻率在突變前后差異較小，其余SNPs位點的等位基因頻率在突變前后均有明顯差異。

表2 中國荷斯坦牛TLR1基因的SNPs位點突變類型及等位基因頻率估算Table 2 SNPs locus mutation types and estimation of allele frequency of TLR1 gene in Chinese Holstein cattle

2.3 SNPs中國荷斯坦牛TLR1基因影響mRNA二級結(jié)構

由圖2可知，中國荷斯坦牛TLR1基因SNPs突變前后，mRNA二級結(jié)構發(fā)生改變，導致其最小自由能從突變前-628.48 kcal·mol-1增加到-482.80 kcal·mol-1，使mRNA二級結(jié)構的穩(wěn)定性發(fā)生了改變，對蛋白質(zhì)的翻譯可能會造成一定的影響。

圖2 中國荷斯坦牛TLR1基因mRNA二級結(jié)構Fig.2 mRNA secondary structure of TLR1 gene in Chinese Holstein cattle

2.4 中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

由表3、表4可知，中國荷斯坦牛TLR1基因編碼的蛋白質(zhì)由727個氨基酸組成，氨基酸組成數(shù)量和頻率如表4所示，其中亮氨酸(Leu)頻率最高，為14.3%，色氨酸(Trp)頻率最低，為1.4%，這2種氨基酸的頻率之差為12.9%。由表3可知，TLR1基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為C3742H5871N979O1090S32，分子質(zhì)量為83.041 kDa，負電荷殘基總數(shù)(Asp + Glu)為72，正電荷殘基總數(shù)(Arg + Lys)為59。編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定指數(shù)為45.64，大于40，說明該蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.5 中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)疏水性/親水性預測和分析

由圖3可知，第523位異亮氨酸(Ile)疏水性最強(+3.400)；第700位谷氨酸(Glu)疏水性最弱(-2.800)。親水性氨基酸占整條氨基酸肽鏈的47.43%，疏水性氨基酸占整條氨基酸肽鏈的52.57%，總體表現(xiàn)為疏水性。由此推斷，TLR1蛋白質(zhì)是一種非可溶性蛋白。

表3 中國荷斯坦牛TLR1基因編碼蛋白質(zhì)理化特性Table 3 The encoding a protein physicochemical properties of TLR1 gene in Chinese Holstein cattle

2.6 中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)信號肽分析

利用Signal P信號肽預測工具，采用神經(jīng)網(wǎng)絡法對中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)信號肽進行分析，結(jié)果中包括C值、Y值、S值3個重要參數(shù)。其中，C值是指剪切位點值，每個氨基酸會有1個C值，在剪切位點處C值是最高的；S值是指每個氨基酸對應的1個S值，在結(jié)果中有一條曲線顯示S值的變化趨勢，信號肽區(qū)域的S值較高；Y值是用來綜合考慮S值和C值的參數(shù)，較單獨考慮C值更為精確。因此，在一條系列中C值可能有不只一個較高的位點，但是剪切位點只有一個；此剪切位點可由Y-max值來推測，且該剪切位點處的S值陡峭，C值最大。中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)信號肽分析結(jié)果如圖4所示，中國荷斯坦牛TLR1基因編碼產(chǎn)物C值為0.427，Y 值為0.586，S值為0.950，其切割點位于30位的氨基酸左右，分值曲線與TLR家族其他成員相似，由此預測荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)存在信號肽。

表4 中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 4 The amino acid composition of TLR1 protein in Chinese Holstein cattle

2.7 中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)的N-糖基化位點分析

由圖5可知，中國荷斯坦牛TLR1編碼蛋白質(zhì)中有 6個潛在N-糖基化位點，分別為Asn31、Asn96、Asn176、Asn260、Asn330、Asn369。蛋白質(zhì)糖基化是指糖蛋白的蛋白結(jié)構共價結(jié)合糖鏈結(jié)構形成的位點，與蛋白質(zhì)的高級結(jié)構存在密切聯(lián)系，具有定向調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，并參與包括細胞識別、細胞分化、發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導、免疫應答等各種重要的生命活動[15]。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心血管病、代謝性疾病、免疫性疾病及感染性疾病中，均伴隨著蛋白質(zhì)糖基化異常的發(fā)生[16]。N-糖基化位點存在的越多，發(fā)生異常的可能性越大，對機體的免疫應答亦會有影響。由此預測，中國荷斯坦牛TLR1基因可能與乳房炎的發(fā)生密切相關。

2.8 突變前后中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)功能預測分析

由表5可知，多種與免疫相關因子的幾率相對較高，其中生長因子的幾率為2.857，脅迫應答和免疫應答的幾率分別為2.534和1.447，幾率最高的是荷爾蒙，達到17.538。由此預測，中國荷斯坦牛TLR1基因在免疫調(diào)節(jié)和機體生理調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用，與牛的抗病能力提高密切相關。

注：正值：親水；負值：疏水。Note:Positive value：Hydrophobicity. Negative value: Hydrophilicity.圖3 中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)疏水性/親水性預測分析結(jié)果Fig.3 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction results in Chinese Holstein cattle TLR1 protein

圖4 中國荷斯坦牛TLR1蛋白的信號肽分析結(jié)果Fig.4 Signal peptide analysis results in Chinese Holstein cattle TLR1 protein

圖5 中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)的N-糖基化位點預測結(jié)果Fig.5 N-glycosylation site prediction results in Chinese Holstein cattle TLR1 protein

GO功能 GO function幾率 Probability信號轉(zhuǎn)導 Signal transduction1.271受體 Receptor0.047荷爾蒙 Hormone17.538結(jié)構蛋白 Structural protein0.107運載體 Transporter0.394離子通道 Ion channel1.386電壓門控離子通道 Voltage-gated ion channel0.136陽離子通道 Cationic channel0.217轉(zhuǎn)錄 Transcription0.242轉(zhuǎn)錄調(diào)控 Transcriptional control0.248脅迫應答 Stress response2.534免疫應答 Immune response1.447生長因子 Growth factor2.857金屬離子轉(zhuǎn)移 Metal ion transfer0.056

2.9 突變前后中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構預測分析

由表6、圖6可知，突變后，α-螺旋(alfar helix, Hh)變化量最大，含量增加了1.24%；β-折疊(beta sheet, Ee)、無規(guī)則卷曲(random coil, Cc)含量均有所減少，其中無規(guī)則卷曲降幅較大，為1.10%，β-折疊減少了0.14%；β-轉(zhuǎn)角(beta-turn, Tt)含量未發(fā)生改變。α-螺旋在中國荷斯坦牛TLR1基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構中含量最高，起主導作用，如果α-螺旋含量發(fā)生改變，該蛋白質(zhì)結(jié)構的穩(wěn)定性也會發(fā)生一定的改變。

對TLR1蛋白進行三級結(jié)構預測，可使用ESypred3D Web Server 1.0同源建模。由圖7可知，TLR1蛋白三級結(jié)構是由多個α-螺旋和β-折疊構成，且2種結(jié)構平行交替排列，構成一個彎曲狀螺旋結(jié)構；突變前后TLR1蛋白三級結(jié)構無明顯變化。

表6 中國荷斯坦牛TLR1基因突變前后二級結(jié)構變化Table 6 Secondary structure changes before and after TLR1gene mutation in Chinese Holstein cattle /%

注：h:α-螺旋; e: β-折疊; t: β-轉(zhuǎn)角; c: 無規(guī)則卷曲。Note:h: α-helix. e: β-strand. t: β-turn. c: Random coil.圖6 中國荷斯坦牛TLR1蛋白二級結(jié)構預測Fig.6 Prediction result of secondary structure in Chinese Holstein cattle TLR1 protein

注：紅色：α-螺旋；黃色：β-折疊；綠色：β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。Note: Red: α-helix. Yellow: β-strand. Green: β-turn and random coil.圖7 中國荷斯坦牛TLR1蛋白三級結(jié)構模型預測Fig.7 Prediction result of tertiary structure in Chinese Holstein cattle TLR1 protein

3 討論

TLR1基因在動物中的研究已有大量報道。Vahana等[17]研究發(fā)現(xiàn)在水牛肝臟、肺臟、脾臟、心臟中TLR1基因表達量較高，而在腎臟、卵巢中的表達量較低或不表達，而陳亞冰等[1]研究表明，TLR1基因在牦牛腎臟和卵巢中的表達量較高，并提出這可能與牦牛的局部組織免疫有關。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)與水牛TLR1基因類似，鯉魚的TLR1基因同樣在脾臟中表達量較高，但不同的是，其在鯉魚的后腸和口腔上皮細胞中表達較低，表明物種不同，TLR1基因表達的差異較大。Yang等[19]研究表明，非功能性TLR1602S/S 基因型可能通過減少Th1細胞反應，降低幽門螺桿菌感染相關胃病的發(fā)病風險。Hawn等[20]和Omueti等[21]研究發(fā)現(xiàn)TLR1多態(tài)性可調(diào)節(jié)對脂肽的先天性免疫應答反應和對廣譜致病菌的臨床易感性。Schumann等[22]研究表明，在廣東漢族人群樣本中，未發(fā)現(xiàn)在歐洲和非洲人群中高頻且與疾病易感的非同義 SNPs 位點+1805G/T (Ile602Ser，rs5743618)，且有證據(jù)表明，Ile602Ser位于TLR1跨膜區(qū)的SNP位點能調(diào)節(jié)細菌脂肽的識別，從而影響天然免疫應答和對一些病原體的臨床易感性。在免疫研究方面，Moisan等[23]認為TLR1作為TLRs的亞家族，表達于多種免疫細胞受體，在免疫應答和感染中起重要作用，且與哮喘炎癥及氣道重塑有密切聯(lián)系，這與本研究結(jié)果類似。本研究中，中國荷斯坦牛的TLR1基因與荷斯坦牛的免疫調(diào)節(jié)、生理調(diào)節(jié)均有密切聯(lián)系。

截至目前，已發(fā)現(xiàn)15種TLRs，其中包含人體內(nèi)TLR1-TLR10及TLR14；小鼠體內(nèi)TLR11-TLR13；雞體內(nèi)存在TLR15[24]，且與其抗病力顯著相關[5]；對荷斯坦牛TLRs基因多態(tài)性的研究主要集中在TLR2和TLR4基因，而國內(nèi)關于對荷斯坦牛TLR6基因的研究[25-26]尚鮮見報道，而對中國荷斯坦牛TLR1基因的研究更為稀少，李春苗等[4]發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛TLR1編碼區(qū)(coding sequence, CDS)有4個SNP突變，但僅一個是非同義突變。Russell 等[3]對TLR1基因5′端和CDS區(qū)SNP突變進行了檢測，發(fā)現(xiàn)-79.T>G和3′端UTR區(qū)+2 463C>T顯著影響臨床乳房炎(clinicalmastitis, CM)發(fā)生。陳亞冰等[1]研究發(fā)現(xiàn)麥洼牦牛TLR1基因的主要功能是協(xié)助TLR2增強對病原體相關分子模式的識別能力，TLR2與TLR1形成的異源二聚體可識別分枝桿菌三酰脂蛋白，并能夠增強對PAMPs的特異性識別，因此TLR1也被認為是乳房炎易感性候選基因。

蛋白質(zhì)是生命活動的承擔者，在基因調(diào)控中起著重要的作用，同時其結(jié)構又會影響物種的生命活動代謝，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構、二級結(jié)構以及高級結(jié)構互相影響，發(fā)揮著一定的生理學功能[27]。本研究發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦牛TLR1基因中存在A61T-TLR1、C632A-TLR1、C1408T-TLR1、C1451T-TLR1、A1461G-TLR1、A1475C-TLR1、G1550A-TLR1、G1596A-TLR1共8個SNPs位點，導致5個氨基酸發(fā)生突變，這與Russell等[3]和李春苗等[4]研究結(jié)果部分相同。Russell等[3]和李春苗等[4]研究發(fā)現(xiàn)SNPs位點僅有一個相同，即A1475C-TLR1，且為同義突變，而本研究中8個SNP位點中有3個同義突變，其余皆為錯義突變，這可能與奶牛群體不同有關。寧夏回族自治區(qū)和河北地區(qū)的環(huán)境、管理和選育模式的差異在一定程度上也會影響荷斯坦牛的遺傳背景，從而導致結(jié)果產(chǎn)生差異。本研究結(jié)果表明，A61T-TLR1、C1408T-TLR1、G1550A-TLR13個SNPs在突變前后基因頻率差異較大，可能對中國荷斯坦牛乳房炎有顯著影響。本研究結(jié)果表明，中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)的二級結(jié)構主要由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲組成，其中以α-螺旋為主，其含量遠大于其他二級結(jié)構，對該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性具有顯著影響，且該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白[28]；中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)的三級結(jié)構在突變前后未有較大改變，預測結(jié)果與二級結(jié)構預測結(jié)果一致，結(jié)構的改變，導致與其相關的功能及其抗病能力也會發(fā)生一定程度的改變。蛋白質(zhì)N端含信號肽，蛋白質(zhì)肽鏈經(jīng)過引導可進入腔內(nèi)，從而定位蛋白質(zhì)[29]。蛋白質(zhì)的氨基酸序列中既含有決定蛋白質(zhì)定位和靶向修飾的信號，還有決定蛋白質(zhì)壽命信號[28]。本研究發(fā)現(xiàn)TLR1基因信號肽的切割點位于30位的氨基酸左右，它對于外分泌蛋白的分泌起主導作用，表明中國荷斯坦牛TLR1基因?qū)C體的免疫應達具有重要影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在中國荷斯坦牛TLR1基因編碼的蛋白質(zhì)中有6個潛在的N-糖基化位點，蛋白質(zhì)糖基化主要修飾天冬酰胺上的N端，通過影響免疫分子的結(jié)構和功能，進一步影響機體對抗原的應答反應[30]。經(jīng)過對中國荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)功能的預測發(fā)現(xiàn)，多種與免疫相關因子的幾率相對較高，與中國荷斯坦牛的免疫能力有較大的相關性；與荷爾蒙相關的幾率最高，表明TLR1基因?qū)χ袊伤固古５纳碚{(diào)節(jié)具有重要影響，與該品種牛乳房的正常生理功能有密切的聯(lián)系。

4 結(jié)論

本研究通過對中國荷斯坦牛TLR1基因進行多態(tài)性分析和蛋白質(zhì)功能預測，發(fā)現(xiàn)該基因與中國荷斯坦牛的免疫能力與生理機能有密切相關，且對中國荷斯坦牛的乳房炎具有顯著影響。今后工作應進一步對中國荷斯坦牛乳房炎的相關因子進行研究，為中國荷斯坦牛的抗病育種供理論基礎。