山桃幼苗響應鎘脅迫的生理機制研究

羅彩云 王建武

(榆林學院/陜西省陜北礦區生態修復重點實驗室，陜西 榆林 719000)

重金屬是嚴重影響外界環境的主要污染因子之一，其中以鎘(Cd)污染最為嚴重。據報道，我國農業土壤的Cd位點污染率已達到7%，Cd已成為我國土壤重金屬污染的首要污染物[1]。前人嘗試應用多種物理和化學方法修復Cd污染土壤，但這些方法普遍存在價格昂貴、對土壤損傷較大、抑制農作物生長等問題[2]。植物修復技術因具有花費少、效果好、對土壤無損害等特性[3-4],已成為當前研究熱點之一。

研究表明，植物修復土壤Cd污染的主要途徑是將一定量的Cd從地下部位吸收轉移至地上部位，從而降低土壤中Cd含量。不同植物品種的吸收能力存在差異，且植物生長時期、Cd脅迫時間、土壤重金屬含量、土壤pH值等對植物Cd的吸收和分布均有顯著影響[5-6]。Cd對植物主要的毒害作用表現為葉片枯萎、生長抑制、呼吸作用和氮代謝紊亂、抑制光合作用、影響水分和礦質元素吸收等，同時導致活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量上升而誘導氧化脅迫，繼而造成膜脂質過氧化、蛋白氧化、酶活降低、核酸降解等[7-8]。為緩解ROS誘導的氧化脅迫，植物將會發揮多種抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等，以及抗氧化劑[如抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)、類胡蘿卜素(carotenoid)等]的作用，以清除過量ROS[9]。此外，非蛋白硫醇(non-protein thiol，NPT)和植物螯合素(phytochelatins，PCs)的螯合作用，以及細胞壁固定作用和液泡的區室化作用對降低Cd對植物的毒害效應亦具有重要意義[10-11]。

目前已報道的Cd超積累植物包括三葉鬼針草、龍葵、東南景天等草本植物，但其生物量較小，對生長環境要求較高，富集程度較低，對土壤重金屬修復效果有限[12-14]。因此，篩選出生物量大，且對Cd具有一定積累、富集能力的木本植物已成為研究熱點[15]。前期研究發現，榆林山桃樹對陜北麻黃梁礦區土壤中的Cu、Zn、Pb、Cd、Cr、As等重金屬污染物具有一定修復效應，尤其對Cd吸附能力較強，可使土壤中Cd含量降低62.61%。然而，其生理機制尚不清晰。因此，本研究以一年齡的山桃樹為試驗材料，探討不同Cd脅迫時間對山桃幼苗光合作用、氧化還原水平、內源硫代謝物含量等的影響，以及Cd在山桃體內的分布情況，以期揭示山桃抗Cd脅迫的作用機理，為山桃在土壤重金屬污染修復中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試苗木為一年生實生山桃苗(Amygdalusdavidiana)，購自河北定州市誠信苗圃場。

供試土壤為沙壤土，基本理化性質為pH值6.12、有機質24.29 g·kg-1、全氮1.24 g·kg-1、堿解氮131.04 mg·kg-1、有效磷16.58 mg·kg-1、速效鉀158.36 mg·kg-1，土壤Cd含量為0.018 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

采用盆栽試驗，將山桃苗根系土壤沖洗干凈(盡量避免根系損傷)，移栽至裝有5 kg園土的花盆(38 cm×31 cm×13 cm)中，每盆種植1株苗，澆施足量水以后，進行常規管理。為獲得足夠的測試樣本，對照(CK)和Cd處理分別種植80株，種植培養條件一致。待苗木全部恢復生長后進行Cd脅迫處理。各處理均重復3次。

前期預試驗篩選得到Cd2+處理最優濃度為10.0 mg·kg-1土壤。稱取適量的CdCl2·2.5H2O(分析純，上海邁瑞爾化學技術有限公司)配置成10.0 mg·L-1濃度的溶液，每盆植株澆施500 mL處理液，以未添加Cd處理的山桃幼苗為對照(CK)。于處理1、15、30、90 d后分別收集各時期的CK和處理組的山桃幼苗葉片，每株植物取葉片2～3片。輕輕刨開山桃幼苗，收集整個植株的根系，先用自來水沖洗干凈，然后將根浸入10 mmol·L-1EDTA-Na2溶液中交換20 min，將根系表面吸附的Cd去除，再去離子水沖洗次3次，吸水紙吸干根部表面水分，用于組織及亞細胞Cd含量的測定。Cd處理后的培養過程，用等量去離子水進行養護，以維持山桃生長所需，同時注意防止雨水污染。

1.3 測定項目與方法

丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量測定：參照張志良等[16]的方法。稱取0.5 g山桃葉片組織，加入10 mL 0.5%(m/v)三氯乙酸進行充分研磨，將研磨液倒入10 mL離心管中，3 000×g離心10 min，取2 mL上清液與2 mL 0.67%(m/v)硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)充分混勻后，100℃水浴鍋中反應30 min，于冰上迅速冷卻，3 000×g離心10 min，取上清液，利用紫外分光光度計在450、532和600 nm波長處測定吸光度值。按照公式分別計算測定液中MDA濃度(CMDA，μmol·L-1)和提取液中MDA濃度(μmol·mL-1)：

CMDA=6.45(A532-A600)-0.56A450

(1)

式中，A450：450nm波長下的吸光度值；A532：532 nm波長下的吸光度值；A600：600 nm波長下的吸光度值。

提取液中MDA濃度=CMDA×反應液體積/1 000×測定時提取液用量

(2)。

按照公式計算樣品中MDA含量(μmol·g-1FW)：

MDA含量=提取液中MDA濃度×提取液總量/植物組織鮮重

(3)。

1.3.2 葉片光合作用和葉綠素含量測定 選取充分伸展的山桃最上端葉片，利用LI-6400XT便攜式光合測定儀(LI-COR 公司，美國)測定凈光合速率(net photosynthetic rate, Pn, mmol CO2·m-2·s-1)、蒸騰速率(transpiration rate, Tr, mmol·m-2·s-1)、氣孔導度(stomatal conductance, Gs, mol·m-2·s-1)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration, Ci, mol·mol-1)，選用紅藍光源，光強為1 000 μmol·m-2·s-1。葉室溫度約25℃，每次測定時間為10:00-14:00。

參照文獻[15]的方法進行山桃幼苗葉片葉綠素的提取和測定：稱取0.2 g山桃葉片于研缽中，加入適量石英砂、碳酸鈣粉和2～3 mL 95%乙醇，研磨成勻漿，然后加入9～10 mL 95%乙醇，繼續研磨至組織變白，靜置3～5 min，過濾至25 mL棕色容量瓶中，用乙醇潤洗殘渣 2～3次，并過濾。用95%乙醇沖洗漏斗中的殘渣至無色，加乙醇于容量瓶中，定容至25 mL。搖勻后，以95%乙醇為空白對照，測定其在663和645 nm波長下的吸光度值。按照公式分別計算葉綠素a(Cchla，mg·g-1FW)、葉綠素b(Cchlb，mg·g-1FW)含量：

Cchla=A ×提取液體積(mL)/組織鮮重(g)

(4)

Cchlb=B×提取液體積(mL)/組織鮮重(g)

(5)

式中，A=12.72OD663-2.69OD645；B=22.88OD645-4.68OD663。

1.3.3 葉片礦質元素含量測定 取新鮮葉片用雙蒸水沖洗干凈，110℃殺青1 h，70℃烘干至恒重，用研缽將干葉研成粉末。準確稱取0.5 g葉片粉末，加入5 mL HNO3-H2SO4-HClO4消解完全[17]，定容至25 mL，利用 OPTIMA 2000A ICP-OES電感耦合等離子體發射光譜儀(美國 PerkinElmer公司)測定樣品中Mg、Cu、Fe、Mn的含量。

1.3.4 抗氧化酶活性和抗氧化物質含量測定 參照趙秀峰等[18]的方法測定山桃幼苗葉片SOD、CAT、POD活性；參照徐瑩[19]的方法測定谷光甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)活性；參照Anderson[20]的方法測定GSH含量；參照張志良等[16]的方法測定AsA含量。

1.3.5 硫代謝相關酶活性和代謝物含量的測定 參照Khan等[21]的方法測定ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase, ATP-S)活性；參照Giatonde[22]的方法測定半胱氨酸(cysteine，Cys)含量；參照Zhang等[23]的方法測定非蛋白硫醇(non-protein thiol，NPT)和植物螯合素含量(phytochelatins，PCs)。

1.3.6 Cd在植物組織的含量和亞細胞分布 分別收集脅迫處理后的山桃葉片、根，稱量鮮重，測量長度，110℃殺青1 h，70℃烘干至恒重，稱量干重。干樣用HNO3-HClO4(4∶1，v/v)消煮(160℃)至澄清，定容后，利用iCETM3300 AAS原子吸收分光光度計(美國Thermo Scientific公司)測定各組織中Cd含量。

采用差速離心法分離不同的亞細胞組分：稱取0.2 g山桃葉片或根于預冷的研缽中，加入10 mL預冷的提取緩沖液[250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl (pH值7.5)和10 mmol·L-1二硫蘇糖醇]，研磨至勻漿，300 r·min-1離心10 min，沉淀即為細胞壁組分(F1)，取上清液于2 000 r·min-1離心15 min，沉淀為細胞核與葉綠體部分(F2)，上清液于10 000×g離心20 min，沉淀為線粒體部分(F3)，上清液即為含有液泡的可溶性組分(F4)。F2與F3合為細胞器組分。將提取出的各組分進行微波消解，利用原子吸收法測定Cd含量，消解液組成為5 mL HNO3和1 mL H2O2，消解后利用iCETM3300 AAS原子吸收分光光度計(美國Thermo Scientific公司)測定Cd含量，其中F4組分直接上機測定[24]。

1.4 數據統計

所得數據為相對每個時期的對照水平的相對值。采用SPSS 18.0對試驗數據進行統計分析，各處理間數據采用方差分析，顯著性差異水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 Cd處理時間對山桃幼苗氧化脅迫和光合作用的影響

山桃幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b含量隨著Cd處理時間的延長整體均呈降低的趨勢，但15和30 d間無顯著差異。葉綠素a/b隨著Cd處理時間的延長呈先升高后降低的趨勢，表明在15 d前，Cd處理對葉綠素b的影響大于葉綠素a，15 d后，Cd處理對葉綠素a的影響較大。山桃幼苗葉片Pn隨著處理時間的延長呈顯著下降的趨勢。結果表明，Cd處理可使山桃幼苗光合作用受到抑制。

2.2 Cd處理時間對山桃幼苗葉片中與光合作用密切相關的金屬元素含量的影響

Mg、Fe、Cu、Mn在光合電子傳遞鏈中和葉綠素的形成起著重要的作用，缺乏任何一種元素都會對植物的光合作用造成較大影響。由表2可知，Mg和Mn在Cd處理后1 d較CK分別顯著下降33.63%和43.94%，在處理后15、30 d的下降趨勢均較為平緩，90 d后下降速度加快。Cu和Fe含量在Cd處理后均顯著上升，其中Cd處理后1 d的含量均急劇增加，而在Cd處理后15、30和90 d上升幅度均趨于平緩。推測Cd處理誘導的山桃幼苗光合抑制和葉綠素含量降低與山桃對Mg、Mn的吸收受到抑制有關。

表1 Cd處理時間對山桃幼苗葉片氧化脅迫和光合作用的影響Table 1 Effects of Cd treatments time on oxidative stress and photosynthesis in Amygdalus davidiana seedlings

注：同行不同小寫字母表示各處理時間間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lowercase letters in the same line indicate significant difference among treatment time at 0.05 level. The same as following.

表2 Cd處理時間對山桃幼苗葉片礦質元素含量的影響Table 2 Effect of Cd treatment time on mineral content in leaves of Amygdalus davidiana seedlings

2.3 Cd處理對山桃幼苗葉片抗氧化保護酶活性和抗氧化物質含量的影響

由表3可知，SOD和CAT活性在Cd處理后1 d急劇上升，在處理后15 d進一步得到提升，在處理后30 d，二者活性均明顯下降，但仍高于CK。POD活性在Cd處理后15 d前雖有所上升，但與CK間無顯著差異，在Cd處理15 d后，其活性顯著提升，其中Cd處理90 d的POD活性較CK顯著提升2.73倍。GR活性隨著Cd處理時間的延長而顯著增強。Cd脅迫下，山桃幼苗葉片中抗氧化物質AsA和GSH含量隨著Cd處理時間的延長均顯著增加，在Cd處理后15～30 d二者的增幅度變緩，在Cd處理后30～90 d時AsA與GSH含量的增幅均有所提升。結果表明，在山桃幼苗葉片中，不同抗氧化保護酶和抗氧化物質在各Cd處理時期所起的作用存在差異，處理前期(15 d前)以SOD、CAT和GR為主，而后期主要發揮POD和GR的功能，抗氧化物質AsA和GSH在整個Cd脅迫響應過程中均發揮了重要作用，以維持山桃幼苗葉片中ROS水平的穩定。

2.4 Cd處理時間對山桃幼苗葉片硫代謝的影響

ATP-S是植物體內硫同化過程中的關鍵酶，Cys是植物體內硫醇化合物合成的基礎成分。由表4可知，山桃幼苗中ATP-S活性和Cys含量在Cd處理后1～90 d之間均顯著上升，尤其是在處理后1 d內，ATP-S活性和Cys含量較CK分別增加1.12倍、1.04倍，Cd處理后30 d增幅有所減緩，但與CK間均存在顯著差異。結果表明，Cd處理可以顯著提升山桃幼苗葉片硫同化代謝。對山桃幼苗葉片中重金屬螯合劑NPT和PCs而言， 二者含量在Cd處理15 d前，與CK間均無顯著差異；在Cd處理30 d后，其含量均顯著上升；在處理后90 d，NPT和PCs含量分別是CK的1.96倍和2.43倍。結果表明，在山桃幼苗葉片中，NPT和PCs在Cd處理后期才發揮其功能，以緩解Cd毒害。

2.5 山桃幼苗體內Cd含量的分布

由表5可知，山桃幼苗根和葉片的組織、亞細胞中的Cd含量隨著Cd處理時間的延長均呈顯著上升的趨勢，且根中的Cd含量大于葉片，說明根系對Cd的吸收積累能力強于葉片。進一步分析Cd在山桃幼苗體內亞細胞分布情況發現，根細胞壁的Cd含量最多，其次是含有液泡的可溶性組分，細胞器組分中的Cd含量最低。葉片中Cd主要分布在含有液泡的可溶性組分中，細胞壁中Cd含量也較高。在葉片與根的3個亞細胞組分中，Cd含量均隨著Cd處理時間的延長而增加。綜上，細胞壁和液泡是山桃幼苗富集Cd的主要部位。

表3 Cd處理時間對山桃幼苗葉片抗氧化保護酶相對活性與抗氧化物質相對含量的影響Table 3 Effects of Cd treatment time course on relative activity of antioxidant enzymes and relative content of antioxidants in leaves of Amygdalus davidiana seedlings

表4 Cd處理時間對山桃幼苗葉片硫代謝的影響Table 4 Effect of Cd treatment time course on S-metabolism in Amygdalus davidiana seedlings

3 討論

根據逆境脅迫的強度和持續時間，可將植物響應逆境脅迫過程分為四個階段[25]：1)起始預警階段：該階段會導致植物的快速應激反應，使植物的抗逆能力下降；2)適應階段：該階段會持續數天，植物會發生各種生理生化代謝反應，以建立一個新的內穩態系統；3)維持期：新建立的內穩態系統在該階段會維持在一個較穩定的水平；4)植物由于長時間的逆境脅迫，將導致建立的新的內穩態系統紊亂，從而進入衰退期。每一個階段對應植物不同的生理響應機制。

植物在逆境脅迫下維持葉片葉綠素含量的穩定，對維持植株正常的光合作用和提升植株抗逆能力至關重要，其中葉片中葉綠素a/b值的變化是關鍵。葉綠素a/b值越高，表明葉綠素a分子被光能激發的越多，由于葉綠素a對遠紅光的吸收可直接參與光化學反應，因此葉綠素a/b值越高，植株光合效率越高。葉綠素b主要吸收藍紫光，作為天線色素之一對植物的光合作用亦起著至關重要的作用[28]。研究發現，Cd脅迫下的楊樹、樟樹葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a/b值顯著降低[15, 29-31]，這與本研究結果不同。這是因為上述報道均是研究不同Cd處理濃度對不同植物品種的生理影響，未研究不同Cd脅迫時期對植物光和色素的影響。本研究中，Cd脅迫可導致山桃幼苗葉片葉綠素a和葉綠素b含量顯著降低，而葉綠素a/b值隨著Cd處理時間的延長呈先升高后降低的趨勢，表明Cd處理前期對山桃幼苗葉綠素b合成的抑制作用大于葉綠素a，抑制了山桃幼苗對藍紫光的吸收；后期主要影響葉綠素a的合成，抑制山桃幼苗對遠紅光的吸收，最終導致光合作用受到抑制，光合速率降低。

表5 Cd脅迫下山桃幼苗組織和亞細胞中Cd分布情況Table 1 The tissue and subcellular distribution of Cd in Amygdalus davidiana seedlings under Cd stress

注：同列不同小寫字母表示同一器官不同處理時間間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among different treatment time with the same organ at 0.05 level.

目前，關于Cd誘導葉綠素含量降低的機理主要存在2種爭議，一是認為Cd脅迫影響植物對Fe、Mg、Mn、Cu等礦質元素的吸收，間接抑制了葉綠素的生物合成而使葉片失綠；另一種則認為Cd脅迫誘導葉綠體合成抑制而間接導致失綠癥[31]。本研究發現在Cd脅迫下的山桃幼苗葉片中Fe、Cu含量均顯著上升，而Mg和Mn含量顯著降低。Mg是葉綠素a和葉綠素b中卟啉環的重要組成部分，Mn是葉綠素合成的酶促反應輔助因子，說明Cd脅迫誘導的葉綠素含量降低不是由Fe、Cu引起的，而與Mn和Mg的吸收受抑制有關。Mn不僅參與葉綠素的合成，還是放氧復合體(oxygen-releasing complex，OEC)的重要組成部分，而OEC是光系統Ⅱ(PSⅡ)的最主要結構單元，Mn聚集體的破壞會抑制H2O的光解，導致電子傳遞受阻，PSII氧化端的電子供給不足，影響光能與電能之間的轉換，最終導致光合作用受限[18, 31]。因此，本研究中山桃幼苗葉片中Mg和Mn含量的降低是光合速率降低的主要原因。這與Cd處理導致楊樹對Mn2+吸收受到抑制，從而影響楊樹葉片葉綠素合成，脅迫使PSⅡ反應中心氧化端出現電子傳遞障礙的研究結果一致[31]。

抗氧化酶促反應(SOD、CAT、POD等)和抗氧化物質非酶促反應(AsA、GSH等)是清除逆境脅迫誘導植物產生過量ROS的兩種主要方式，但抗氧化酶活性和抗氧化物質含量隨植物物種、逆境脅迫種類、脅迫濃度和時間的變化而不同[26]。研究發現，SOD、CAT、POD活性的提高是一種應急解Cd毒措施，以免植物遭受ROS誘導的氧化脅迫，但其調節Cd毒害的能力有限，高濃度Cd環境或者長時間Cd脅迫會使這些抗氧化酶活性和抗氧化物質含量顯著降低[15]。本研究中，在Cd處理1和15 d后，山桃幼苗葉片SOD、CAT活性均顯著上升，在Cd處理30和90 d則降低，POD活性在Cd處理15 d前呈上升趨勢，但與CK間無差異顯著，而在Cd處理15 d后顯著上升，表明SOD、CAT在山桃幼苗響應前期Cd脅迫中起主要作用，而在Cd處理30 d后POD發揮重要作用。此外，GSH-AsA循環在小白菜抵抗Cd誘導產生的ROS而引發的氧化脅迫過程中具有重要作用，而GR是催化GSH-AsA循環的關鍵酶，其活性在Cd處理后的小白菜幼苗中顯著上升，從而促進了基于GSH-AsA循環的ROS清除系統功能[32]，這與本研究結果一致。

植物體內NPT、PCs等硫醇類化合物可與重金屬Cd進行螯合，然后將其轉運至液泡中，從而降低Cd對植物的傷害，因此NPT、PCs在解Cd毒過程中發揮著重要作用[33]。研究表明，NPT和PCs含量在Cd、Pb、Zn等脅迫后的植物體內顯著上升[33]，這與本研究結果不同。本研究中，ATP-S和Cys含量在Cd處理后顯著上升，硫醇代謝物NPT和PCs含量在Cd處理前期變化不顯著，在處理30 d后顯著上升，但GSH在Cd處理后的山桃幼苗葉片中顯著上升。推測在Cd處理早期(15 d前)，山桃幼苗葉片中的硫同化過程主要以合成GSH為主，而在Cd處理30 d后，需要發揮NPT、PCs和GSH的功能，以緩解長期Cd處理對山桃幼苗造成的傷害。

細胞壁的草酸氧化酶、果膠、半纖維素可以與Cd2+結合，構成植物重金屬防御的第一道屏障[24]。本研究發現山桃幼苗根中Cd含量顯著大于葉片，表明根是山桃幼苗吸附Cd的主要部位。亞細胞分布情況表明，根中Cd主要富集在細胞壁中，液泡的區室化作用也發揮了重要功能，而在葉片中，Cd主要富集在液泡中，尤其是在Cd處理30 d后，液泡中的Cd含量極顯著增加。這與Cd處理后期葉片中NPT、PCs含量的變化趨勢，以及Cd在水稻幼苗體內分布的結果一致[24]，表明細胞壁吸附和液泡的區室化作用在山桃幼苗的響應Cd脅迫過程中起著重要作用。

4 結論

本研究結果表明，Cd脅迫導致山桃幼苗葉片ROS水平上升，并影響植株對Mn、Mg離子的吸收，導致葉綠素合成受限，從而影響其光合作用。山桃幼苗Cd脅迫響應前期(15 d)，主要以抗氧化酶(SOD、CAT)和抗氧化物質(GSH、AsA)的作用，清除Cd脅迫誘導產生的過量ROS。而在Cd處理后期，主要發揮抗氧化酶POD和抗氧化物質(GSH、AsA)的ROS清除功能，同時NPT、PCs與Cd的螯合作用，可促進Cd向液泡中轉運，從而降低Cd對植株的毒害。本研究首次研究了不同Cd處理時期下的山桃幼苗響應Cd脅迫的生理特征，對山桃作為潛在的重金屬植物修復材料具有重要的理論指導意義。但對其中的生理機制還需從分子水平作進一步的科學驗證。