基于高通量測序不同生產工藝晴隆酸菜細菌多樣性分析

郭倩倩，盧 彪*

（興義民族師范學院 生物與化學學院，貴州 興義 562400）

傳統發酵蔬菜多是指將不同的蔬菜利用環境中的微生物及各種配料進行發酵處理，使之具有不同風味，并增強了保藏性的蔬菜制品，如四川泡菜[1]、榨菜[2]、東北酸菜[3]、發酵芥菜[4]、剁辣椒[5]等。晴隆酸菜是貴州省黔西南州的特色發酵蔬菜之一，主要以芥菜葉為原料，經自然發酵而成。其具有酸爽可口、回味悠長、柔韌適中等特點，深受食客的喜愛。目前，晴隆酸菜的生產工藝以工廠化生產及家庭作坊式生產兩種方式為主，工廠化生產工藝與家庭作坊生產工藝的最主要區別是工廠化生產在腌制（發酵）初期進行了老酸湯或者菌劑的添加；而家庭作坊式生產僅依靠環境微生物進行自然發酵。

目前，關于酸菜中微生物群落的研究主要集中在乳酸菌多樣性的分析，有文獻報道[6-10]，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為酸菜的優勢菌屬。而關于晴隆酸菜中細菌多樣性的研究尚少見報道。高通量測序技術廣泛應用于傳統發酵食品中微生物多樣性分析[11-13]。關統偉等[14]通過高通量測序技術對郫縣豆瓣全發酵過程中的細菌群落結構、豐度及演替規律進行了研究；劉大群等[15]利用高通量測序技術對不同鹽量榨菜坯料中細菌群落多樣性進行了分析。

本研究采用高通量測序技術分析工廠化和家庭作坊式兩種不同工藝生產的晴隆酸菜中細菌的多樣性，采用熱圖分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）對不同晴隆酸菜酸菜樣品間細菌群落結構相似性進行分析，最后對其優勢細菌屬進行分析，為晴隆酸菜風味研究以及安全性評價奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

晴隆酸菜：市售。包括工廠化生產酸菜樣品分別編號為F1、F2，標記為A組；家庭作坊生產酸菜樣品分別編號為S1、S2、S3，標記為B組。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.R Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：美國OMEGA公司；Qubit3.0DNA檢測試劑盒：美國Life公司；Taq DNA聚合酶（1 000U）：中國Vazyme公司；AgencourtAMPure XP：美國Beckman公司。

1.2 儀器與設備

Pico-21臺式離心機：美國ThermoFisher公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達科技有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；T100TMThermal Cyeler/1861096聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 總DNA提取與檢測

使用E.Z.N.A.R SoilDNA試劑盒提取晴隆酸菜樣品的總DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.3.2 PCR擴增

利用Qubit3.0DNA檢測試劑盒對總DNA精確定量后，以其為模板進行兩輪PCR擴增。第一輪PCR擴增所用引物為V3-V4區通用引物（341 Primer F：5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3'；805 Primer R：5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'）[16]。第二輪PCR擴增所用引物為引入Illumina橋式PCR兼容引物（Primer F：5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG-3；Primer R：5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。第一輪PCR擴增體系：2×Taq masterM ix15μL，341PrimerF（10μmol/L）1μL，805PrimerR（10μmol/L）1μL，基因組DNA 10～20ng，雙蒸水（ddH2O）補充至30μL。PCR擴增條件：94℃、3min；94 ℃、3m in，45 ℃、20 s，65 ℃、30 s，共5個循環；94 ℃、20 s，55℃、20s，72℃、30s，共20個循環；72℃、5min。以第一輪PCR擴增產物為模板進行第二輪PCR擴增，PCR擴增體系同第一輪，PCR擴增條件：95℃、3m in；94℃、20s，55℃、20s，72℃、30 s，共5個循環；72℃、5min。采用AgencourtAMPureXP對PCR擴增產物純化、回收。

1.3.3 測序

回收的PCR擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序平臺為Illum inaM ieq，測序讀長為雙向300bp。

1.3.4 分析方法

高通量測序所得序列通過拼接、過濾、去除嵌合體，得到最終有效序列。利用QIIME劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT），將相似度＞97%的序列定義為一個OTU，每個OTU對應于一種代表序列。基于16SRNA基因數據庫（RDP數據庫、Silva數據庫、NCBINT數據庫）進行16S rRNA基因序列比對、分類學注釋。

2 結果與分析

2.1 基于操作分類單元細菌Alpha多樣性分析

通過拼接、過濾、去除嵌合體，得到最終有效序列。利用QIIME劃分OUT，將相似度＞97%的序列定義為一個OUT，并基于OTU對5種晴隆酸菜中細菌的Alpha多樣性（Shannon指數、Chao1指數和Simpson指數）進行分析[17]，具體結果見表1。

表1 晴隆酸菜中細菌Alpha多樣性分析結果Table 1 Analysis and results of bacterial Alpha diversity in Qinglong sauerkraut

由表1可知，通過高通量測序，從5種晴隆酸菜樣本中共獲得136 943條有效序列，3 214個OUT。所有樣品的Coverage指數均＞0.9，說明樣品文庫中序列的覆蓋率高，可反應樣品測序的真實情況。A組Shannon指數均低于B組，而Simpson指數均高于B組，說明家庭作坊生產酸菜細菌群落多樣性普遍高于工廠化生產酸菜。A組Chao1指數較為相近，而B組Chao1指數相差較大，分析原因可能與B組中不同家庭作坊的生產環境變化較大有關。

2.2 基于門與屬水平的細菌群落結構分析

通過高通量測序分析，從5種晴隆酸菜樣品中共鑒定出細菌門19個，細菌屬416個，結果如圖1所示。由圖1可知，樣品F1中鑒定出8個門91個屬，樣品F2中鑒定出9個門121個屬，樣品S1中鑒定出18個門240個屬，樣品S2中鑒定出8個門167個屬，樣品S3中鑒定出15個門269個屬，且A組（F1、F2）細菌的門與屬明顯低于B組（S1、S2、S3），說明工廠化生產晴隆酸菜中細菌種類在門水平及屬水平上均明顯低于家庭作坊生產晴隆酸菜中的細菌種類。

圖1 樣品中細菌的門與屬數目Fig.1 Phyla and genera num bers of bacteria in allsamples

韋恩圖可以直觀的體現樣品中細菌組成的相似性和重疊情況，因此，對兩組樣品的細菌門、屬數目進行韋恩圖分析，結果如圖2、圖3所示。由圖2可知，工廠化生產晴隆酸菜樣品F1、F2共有細菌門為7個；家庭作坊式生產晴隆酸菜樣品S1、S2、S3共有細菌門為7個。由圖3可知，樣品組內存在共有細菌屬，其中樣品F1、F2共有細菌屬53個；樣品S1、S2、S3共有細菌屬96個。

圖2 工廠化（A）及家庭作坊式（B）生產酸菜細菌門數目韋恩圖Fig.2 Venn diagram of bacteria phyla numbers in sauerkraut produced by factory(A)and fam ily workshops(B)

圖3 工廠化（A）及家庭作坊式（B）生產酸菜細菌屬數目韋恩圖Fig.3 Venn diagram of bacteria genera numbers in sauerkraut produced by factory(A)and fam ily workshops(B)

2.3 基于屬水平、OTU水平晴隆酸菜樣品間細菌群落結構相似性分析

對5種晴隆酸菜樣品中細菌相對豐度前20的細菌屬進行熱圖-聚類分析，結果見圖4。由圖4可知，樣品F1和F2各屬顏色深淺較為接近且為同一聚類，說明工廠化生產的晴隆酸菜細菌群落中各屬組成較為接近。而樣品S1、S2和S3各屬顏色深淺差距較大且不在同一聚類，說明家庭作坊生產的晴隆酸菜細菌群落組成差異較大。

基于OTU水平，采用PCA對5種晴隆酸菜樣品中細菌群落結構的相似性進行分析，結果見圖5。由圖5可知，PC1、PC2、PC3分別解釋了樣品中細菌OUT的58%、23%、11%的信息，累計貢獻率為99%。基于這3個主成分，樣品F1和F2距離較近，說明F1和F2樣品中細菌群落結構相似性較高，即兩種工廠化生產酸菜的細菌群落構成較為相似。A組（F1、F2）和B組（S1、S2、S3）存在一定距離，說明兩組樣品細菌群落結構相似性有一定差異，即工廠化生產晴隆酸菜的細菌群落構成與家庭作坊生產晴隆酸菜區別較大。細菌群落的PCA結果與細菌相對豐度熱圖分析結果較為一致。

圖4 5種晴隆酸菜樣品細菌相對豐度熱圖Fig.4 Heatmap of bacterial relative abundance of 5 Qinglong sauerkraut samples

圖5 5種晴隆酸菜樣品中細菌群落主成分分析Fig.5 Principal component analysis of bacterial community in 5 Qinglong sauerkraut samples

2.4 基于屬水平優勢菌株的分析

在屬水平上對兩種類型晴隆酸菜中的細菌進行分類，統計它們的相對豐度。根據相對豐度≥5.0%確定為晴隆酸菜中的優勢細菌，結果如表2所示。

表2 5種晴隆酸菜樣品中優勢細菌及相對豐度Table 2 Dom inantbacteria and relative abundance of 5 Qinglong sauerkraut samples

由表2可知，在兩種工廠化生產的晴隆酸菜中，優勢細菌屬的種類相同，分別為乳酸球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、大洋桿菌屬（Oceanobacillus）。但不同細菌屬的相對豐度不同，其中樣品F1中Lactococcus相對豐度最高，為26.33%，而樣品F2中Lactobacillus相對豐度最高，為47.94%，均為常見乳酸菌屬。在工廠化生產的晴隆酸菜中的4種優勢細菌屬中，Lactococcus[18-20]、Bacillus[21-22]、Lactobacillus[23-24]均屬于發酵食品常見菌，而Oceanobacillus在食品研究中較少[25]。

3種家庭作坊生產的晴隆酸菜樣品中，優勢細菌屬各有差異，但均含有Lactobacillus，相對豐度分別為5.76%、8.03%、5.16%。在家庭作坊生產的晴隆酸菜優勢細菌屬中，弧菌屬（Vibrio）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium）中存在致病微生物。因此，對于可直接食用的酸菜來說，仍存在較大的食品安全隱患。

3 結論

采用高通量測序技術對兩種不同工藝生產的晴隆酸菜樣品中的細菌多樣性進行分析，結果表明，細菌多樣性方面，5個酸菜樣品中共鑒定出19門，416屬。樣品F1中8門91屬，F2中9門121屬，共有門為7個，共有屬為53個；樣品S1中18門240屬，S2中8門167屬，S3中15門269屬，共有門為7個，共有屬為96個；家庭作坊生產的酸菜的細菌多樣性較工廠化生產的酸菜高；工廠化生產的酸菜細菌群落組成較相近。優勢細菌屬方面，工廠化生產的酸菜優勢細菌屬相同，均為乳酸球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、大洋桿菌屬（Oceanobacillus）。而家庭作坊生產的酸菜優勢細菌屬各有差異，但均含有Lactobacillus，優勢細菌屬中的弧菌屬（Vibrio）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium）中存在致病微生物。