2,4-D處理對大百合種子休眠解除及內源激素變化的影響

李鳳榮 李葉芳 馬詩雨 關文靈

( 云南農業大學園林園藝學院，云南 昆明 650201)

大百合（Cardiocrinum giganteum）是百合科（Liliaceae）大百合屬（Cardiocrinum）多年生鱗莖類草本植物[1]，該屬植物因植株巨大并具有網狀脈的葉片而顯著區別于百合屬（Lilium）植物[2]。大百合植株粗壯挺拔，葉片碩大，花朵潔白芳香，具有極高的觀賞價值，其鱗莖富含多種營養物質，可供食用[3]，也可藥用[4]；果實可入藥，作為馬兜鈴（Aristolochia debilis）的代用品[5]，是優良的野生植物資源。

國內關于大百合的研究主要集中在其引種栽培[6]、組織培養[7]、細胞水平[8]以及雜交[9]等方面。而國外鮮有對大百合屬的研究，主要在其種子生物學[10]、生活史[11]、花粉發育[12]等方面。關文靈等[13]的研究表明大百合種子存在形態和生理后熟現象，其休眠類型屬于復雜的形態生理休眠。蔡薇等[14]研究變溫層積過程中加赤霉素（GA3）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、硝普鈉（SNP）處理對大百合種胚后熟的影響。2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），是一種人工合成的植物生長素，具有促進細胞生長與分化，加速根、芽伸長，促進果實形成與種子萌發等作用[15]。目前，鮮見2,4-D浸種處理對大百合種子休眠解除的研究，也未見內源激素在大百合種子變溫層積過程中變化的研究。本研究采用2,4-D浸種處理結合變溫層積的方法，探究對大百合種子休眠破除的影響，篩選出適宜的濃度，在最佳處理濃度的基礎上，研究大百合種子在不同時期內源激素的動態變化，為揭示內源激素在大百合種子休眠解除過程中的作用提供參考，為種子育苗生產實踐提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用大百合種子，于2015年11月采自云南省哀牢山國家級自然保護區（東經100°44′～101°30′，北緯 23°36′～24°56′），在 4 ℃ 低溫環境下儲存備用。在變溫層積結合激素處理的不同時期，對大百合種子取樣，取樣時間為層積后 0、30、60、90、120、130 d，在各時間點定期取樣，樣品經液氮冷凍后，置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于測定種胚發育過程中植物內源激素。

1.2 試驗方法

1.2.1 預處理方法

以蒸餾水為對照（CK），將大百合種子置于質量濃度分別為1、5、10 mg/L的2,4-D溶液中浸泡48 h；每個處理種子150粒，設置3個重復。將上述浸種的種子裝入尼龍網袋中，再用潮濕的苔蘚覆蓋網袋，最后放入自封袋中，并在自封袋上用牙簽戳 3～4個小孔以保持透氣性。在恒溫箱中進行模擬夏季—秋季—冬季的高溫到低溫的變溫 25 ℃/15 ℃（ 60 d）、15 ℃/5 ℃（ 60 d）、4 ℃（50 d）層積處理，周期性光照（光照12 h，黑暗12 h）。

1.2.2 指標測定方法

1）胚長、胚生長率和發芽率的測定 在變溫層積90、105、120、135 d時，每個處理中隨機抽取10粒種子，在體視顯微鏡（徠卡公司，德國）下沿著與胚平行的方向，測量胚的長度。在變溫層積150 d時，隨機選取100粒，按公式（1）計算胚生長率，共重復3次。當胚根突出珠孔1 mm時，種子視為已萌發，觀察并記錄種子發芽起始時間。每隔5 d，統計100粒種子中的發芽率，并按公式（2）計算。

2）內源激素含量的測定 在變溫層積期間，定期對處理組（5 mg/L 2,4-D）和CK浸泡48 h的種子分別取樣，經液氮冷凍后，保存于-80 ℃超低溫冰箱中；用液-質聯用色譜儀（安捷倫，美國）測定GA3、生長素（IAA）及脫落酸（ABA）的內源激素含量，具體方法參照參考文獻[16]。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0對種胚長度、胚生長率進行單因素ANOVA的Duncan多重比較方法進行顯著性差異分析，對內源激素ABA、IAA和GA3含量進行單樣本T檢驗分析，使用Excel 2013進行數據統計和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 不同濃度2,4-D浸種對大百合種胚長度的影響

由圖1可知，隨著層積時間的增加，不同處理大百合種胚的長度均增長，但在層積90 d時，不同處理間胚長差異不顯著；層積105 d時，CK與5 mg/L 2,4-D處理差異顯著（P＜0.05），與10 mg/L 2,4-D處理差異極顯著（P＜0.01），CK的胚長分別高出5 mg/L 2,4-D和10 mg/L 2,4-D的胚長8.38%、14.74%。層積120 d時，CK與其他處理差異顯著（P＜0.05），與5 mg/L和10 mg/L 2,4-D顯著極差異（P＜0.01），CK的胚長分別高出5 mg/L 2,4-D和10 mg/L 2,4-D的胚長15.28%、15.88%。層積135 d時，CK與5 mg/L 2,4-D處理顯著差異（P＜0.05），5 mg/L 2,4-D處理的胚長高出CK的胚長9.03%。

圖 1 不同濃度2,4-D處理下大百合種胚的長度變化Fig. 1 Length changes of C. giganteum embryos under different concentrations of 2,4-D

2.2 不同濃度2,4-D對大百合種子發芽的影響

由表1可知，CK的胚生長率與5 mg/L 2,4-D和 10 mg/L 2,4-D差異極顯著（P＜0.01）；5 mg/L 2,4-D處理的胚生長率最高，達到82%，比CK高出10%；10 mg/L 2,4-D處理的胚生長率最低，為52.33%，比CK低19.67%。5 mg/L 2,4-D的發芽起始時間最早，為4 ℃下14 d，比CK早11 d。

表 1 大百合種子胚生長率和發芽時間Table 1 Seed embryo growth rate and germination time of C. giganteum

由圖2可知，1 mg/L 2,4-D處理下，種子發芽率高于CK 3%，5 mg/L 2,4-D的發芽率最高，達75.33%，高于CK 15.33%，可促進大百合種子的萌發；10 mg/L 2,4-D的發芽率最低，為36.33%，明顯低于CK，低了30%。結合來看，5 mg/L 2,4-D處理的胚生長百分比最高，發芽時間最早，發芽率最高，利于大百合種胚后熟，可以縮短發芽時間，提高種子萌發。

圖 2 不同濃度2,4-D處理下大百合種子的發芽率Fig. 2 Germination rate of C. giganteum seeds treated with 2,4-D with different concentrations

2.3 大百合種子層積過程中內源激素的動態變化

隨著層積時間的增加，在層積過程中，大百合種子ABA、IAA和GA3含量的變化表現出不同的規律，見圖3。

圖 3 大百合種子層積過程中內源激素含量的變化Fig. 3 Variation of endogenous hormones content in the process of C.giganteum seeds stratification

由圖3a可知，在大百合種子層積過程中，CK和2,4-D處理在ABA含量的變化總體呈下降趨勢。在未變溫層積0 d時差異極顯著（P＜0.01），2,4-D處理比 CK高了 14.53 ng/g；在層積30 d時差異極顯著（P＜0.01），2,4-D處理的比CK低了9.55 ng/g；在層積120 d時差異極顯著（P＜0.01），CK比2,4-D低了5.59 ng/g；在層積60、90、130 d時，處理差異不顯著。CK中ABA含量在層積60 d時，下降速度較快，層積30 d相比，降了14.1 ng/g，在層積120 d時達到最低水平9.82 ng/g；而2,4-D處理的ABA含量在層積30 d時，急速下降，降了31.69 ng/g，在層積60 d時達到最低水平14.14 ng/g。表明2,4-D 5 mg/L處理的ABA含量下降速度的時間比CK早了30 d，最低水平時間比CK早60 d。

由圖3b可知，大百合種子在層積過程中，CK和2,4-D處理在IAA含量上呈先上升后下降的趨勢，不同的層積時間顯著極差異（P＜0.01）。變溫層積0 d時，IAA含量最低，2,4-D處理比CK高出3.98 ng/g；在層積60 d時，IAA含量達到峰值，外源2,4-D抑制內源IAA，CK高達1 954.52 ng/g，比2,4-D處理高出516.66 ng/g；層積120 d時，2,4-D處理的IAA含量上升較快，比 CK高出 173.82 ng/g。IAA含量在層積60 d時，上升速度較快，與30 d相比，CK增長了 1 877.49 ng/g，2,4-D處理增長了 947.2 ng/g，層積90 d時，IAA含量急速下降，與60 d相比，CK降低了1 925.39 ng/g，2,4-D處理下降了1 421.02 ng/g。

由圖3c可知，大百合種子在層積過程中，CK和2,4-D處理在GA3含量的水平變化大體上呈先上升后下降的趨勢。除層積130 d時差異顯著（P＜0.05），其他的層積時間顯著極差異（P＜0.01）。在變溫層積0 d時，2,4-D 5 mg/L處理的GA3含量比CK高出9.86 ng/g；GA3含量在層積120 d時達到峰值，2,4-D處理比CK高出52.17 ng/g，外源2,4-D促進內源GA3；層積120 d，GA3含量上升速度較快，與90 d相比，CK增長了38.4 ng/g，2,4-D處理增長了99.72 ng/g；層積130 d時，GA3含量急速下降，與120 d相比，CK降低了40.01 ng/g，2,4-D處理下降了96.34 ng/g。

2.4 大百合種子后熟過程中各激素含量之間的比值變化

由圖4可知，大百合種子后熟階段IAA/ABA、GA3/ABA之間的比值變化也存在差異，在層積過程中，IAA/ABA、GA3/ABA之間的比值整體上呈先上升后下降的趨勢。

圖 4 大百合種子層積過程中各激素含量之間的比值變化Fig. 4 Changes in the ratio of hormones during stratification of C. giganteum seeds

從圖4a中可以看出，在層積60 d時，IAA/ABA達到峰值，CK比2,4-D處理高了49.24；IAA/ABA變化較大，在層積60 d時，上升速度較快，與30 d相比，CK的IAA/ABA增長了148.1，2,4-D處理增長了73.66；層積90 d時，IAA/ABA急速下降，與60 d相比，CK降低了149.47，2,4-D處理下降了100.84；層積120 d時，2,4-D處理的IAA/ABA比CK高出10.53。從圖4b中可以看出，在層積120 d時，GA3/ABA達到峰值，2,4-D處理比CK高了1.63；GA3/ABA變化較小，在層積120 d時，上升速度較快，與90 d相比，CK的GA3/ABA增長了4.38，2,4-D處理增長了6.47；層積130 d時，GA3/ABA急速下降，與120 d相比，CK降低了4.4，2,4-D處理下降了6.28。IAA/ABA、GA3/ABA上升說明發芽促進物質占相對優勢，種子向萌發的方向發展。

3 結論與討論

種子休眠是植物經過長期的演化而獲得的一種對環境條件及季節性變化的生物學適應性[17]。近年來，國際上對形態生理休眠（MPD）種子的研究已取得了一定的進展，但仍被認為是種子生態學領域中了解最少的休眠類型之一。國內對MPD的研究也才剛剛起步，已有的研究僅限于對部分植物的種子形態和萌發處理，研究還不深入、缺乏系統性。姚林君等[18]系統總結了MPD種子的形態結構、休眠打破的環境需求、MPD的起源與進化以及MPD的植物類群。形態生理休眠特性在木蘭科植物中非常常見，如西康玉蘭（Magnolia wilsonii）[19]。

馮小芹等[20]研究了98%濃硫酸、高溫處理、機械處理等6種不同種子處理方法對漆樹（Toxicdendro vernicifluum）幼苗生長的影響，本實驗采用變溫層積結合激素處理對大百合種子休眠解除的影響。張家玲等[21]用2,4-D對滇重樓（Paris polyphylla）種子萌發進行研究，結果表明90 d時，CK的萌發率為40.33%，0.4 mg/L 2,4-D浸種處理48 h滇重樓種子萌發率最高達53.33%，0.2～0.4 mg/L的 2,4-D可促進滇重樓種子的萌發，而高于0.4 mg/L的2,4-D對種子的萌發具有抑制作用。大百合種子的休眠類型屬于MPD，本研究采用不同濃度2,4-D處理大百合種子，大百合種子的胚不完全伸長，種子也會萌發，在層積135 d時，5 mg/L 2,4-D處理的胚長比CK高出9.03%，胚的長度不能衡量種子休眠解除的程度。5 mg/L 2,4-D處理的胚生長百分比最高，達到82%，發芽時間最早，為4 ℃下14 d；發芽率最高，達75.33%，5 mg/L 2,4-D處理可以縮短發芽時間，提高種子萌發，利于大百合種胚后熟。1 mg/L 2,4-D處理促進作用不明顯，10 mg/L 2,4-D處理起到明顯的抑制作用。

劉序等[22]采用GC-MS方法分析鑒定了香榧（Torreya grandis）種子的外種皮、內種皮和胚乳萃取液中內源物種類及其相對含量，本研究采用LC-MS方法測定了大百合種子層積過程中3種內源激素。Khan[23]提出種子的休眠和萌發由3個因子調節，即萌發促進物質GA3、細胞分裂素和ABA之間的相互作用決定種子休眠與萌發。ABA和GA3是調控種子休眠與萌發的一對拮抗內源激素，IAA對萌發沒有明顯的影響，但間接影響種胚的發育和其他激素水平[24]。大百合種子層積過程中，ABA、IAA和GA3的含量發生不同規律的變化。5 mg/L 2,4-D處理的ABA含量在層積30 d時，急速下降，下降速度的時間比CK早了30 d，在層積60 d時達到最低水平，比CK早60 d。5 mg/L 2,4-D處理的IAA含量和GA3含量在層積的0 d、120 d時，均比CK高。內源激素的相對水平對種子休眠具有重要的調控作用，IAA/ABA在層積60 d達到峰值，CK比5 mg/L 2,4-D高了49.24，GA3/ABA的比值在層積120 d達到峰值，5 mg/L 2,4-D處理比CK高了1.63。

大百合種子的休眠并不是單一因素引起的，而是各種激素共同作用的結果。綜合來看，ABA含量的變化與大百合種胚的發育呈負相關，IAA和GA3可能是促進大百合種子休眠解除的主要調節物質，5 mg/L 2,4-D處理通過抑制ABA而促進種胚的萌發。不同外源GA3處理天女木蘭（Magnolia sieboldii）[25]胚乳中ABA含量隨層積時間大體上呈持續下降趨勢，GA3含量均在種子休眠解除期（120 d）含量達到最大，IAA含量呈先升高后下降的趨勢，并均在層積40 d時達到峰值，隨后逐漸下降，本研究中與天女木蘭胚乳中內源激素含量的變化相似，表明適宜濃度的外源GA3和2,4-D浸種處理有利于種子休眠解除和萌發。

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