治愈乙型肝炎的全球戰略

趙爽 謝青

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個全球性的公共衛生挑戰。國際消除HBV聯盟(ICE-HBV)是一個致力于加快開發治愈慢性乙型肝炎的專家聯盟。未來乙型肝炎治愈的研究將集中于發現干預策略，這種策略將永久減少具有復制能力的受感染細胞的數量或永久沉默這些細胞中共價閉合環狀脫氧核糖核酸，并將刺激HBV特異性宿主免疫反應，模擬HBV感染的自發緩解。還迫切需要建立標準化HBV試劑和方案，供全球所有HBV研究人員使用。

HBV是一個主要的全球公共衛生威脅，全球超過2.57億人慢性感染；每年有超過88 7 000人死于HBV[1]。現有的治療方法可以抑制病毒復制，但不能治愈，主要是由于病毒共價閉合的環狀脫氧核糖核酸(cccDNA)轉錄模板在受感染肝細胞中的持續存在，以及慢性感染患者未能產生足夠強的、功能性和持續的免疫反應來清除感染。因此，在大多數情況下，治療必須終生維持。

ICE-HBV是一個國際性的、獨立的、基于研究的論壇，成立于2016年，旨在加快HBV治愈的研究。該聯盟提出了一個戰略性和協作性的HBV研究議程，以推動發現一種安全、可支付、可推廣和有效的慢性乙型肝炎治愈方法，并在可預見的未來人人都能獲得。

一、慢性乙型肝炎與感染的緩解

急性和慢性乙型肝炎的自發緩解證明了HBV感染的免疫控制是可能的。然而，慢性感染或急性肝炎的臨床緩解并不意味著病毒的完全根除，因為少量的cccDNA陽性肝細胞可以在這些個體中持續存在，并且可能是免疫抑制過程中病毒重新激活的來源[2]。如果要制定從受感染細胞中消除或控制其表達的策略，就迫切需要我們提高對HBV cccDNA的生物發生和同源狀態的理解。

二、HBV治愈的定義

HBV治愈需要考慮治愈HBV感染和相關肝病，由此而變得復雜(圖1)。最近美國肝病研究協會和歐洲肝病研究協會聯合舉辦的HBV治療終點研討會進一步將完全治愈定義為血清中肝乙型肝炎表面抗原(HBsAg)檢測不到，以及包括肝內cccDNA和整合HBV基因在內的HBV基因的根除[3]。功能性治愈被定義為血清中HBsAg和HBV DNA持續不可測(伴或不伴有抗-HBsb血清轉換)以及肝內cccDNA和HBV基因整合量持續較低水平[3]。還提出了第三個定義：部分治愈，定義為在有限療程結束后血清中可檢測到HBsAg，但HBV DNA持續檢測不到[3]。由于目前不可能從每一個被感染的細胞中根除HBV cccDNA微染色體庫或整合的HBV DNA，但功能性治愈仍有可能實現，至少目前是這樣。我們認為慢性HBV感染的治愈性治療策略的理想目標應該是誘導與急性或慢性乙型肝炎緩解控制的那樣得以緩解，只要這種方法是安全的。

圖1乙型肝炎病毒復制周期(摘自： Revill PA, et al. Lancet Gastroenterol Hepatol,2019,4: 545-558)

由于學術界和企業界努力確定病毒靶點來研發藥物，許多藥物正在臨床前模型中進行評估，或處于臨床開發的第一階段(圖2)。這些包括干擾病毒進入的藥物、靶向cccDNA或病毒核糖核酸的藥物或其他方法、新型聚合酶或核糖核酸酶H抑制劑、核心蛋白變構調節劑和衣殼組裝調節劑、干擾HBx功能的藥物、靶向病毒和HBsAg出口的藥物或影響病毒蛋白質組的試劑。其中一些化合物看起來很有希望顯著降低HBV病毒載量或循環HBsAg，或兩者都有顯著降低，并促進抗-HBs的產生，但迄今為止似乎沒有一種化合物能夠治愈HBV感染。這些方法都不是直接針對HBV cccDNA庫，但是將這些方法結合起來進行評估，以確定它們在cccDNA清除動力學中的有效性或它們改善抗病毒免疫應答恢復的能力將是很重要的。

圖2 當前和未來治療和治愈慢性乙型肝炎所需的HBV病毒學和免疫學靶標

乙型肝炎治愈的研究工作應集中于減少每個細胞的cccDNA分子數量和含cccDNA的細胞數量，并誘導HBV特異性免疫應答。為了實現HBV治愈的目標，ICE-HBV提出了兩種策略，即在不殺死被感染細胞的情況下治愈HBV感染和誘導免疫控制以安全消除被感染細胞。這些方法中的每一種都需要有統一協調的臨床研究來支持，以推進HBV治愈。下面詳細描述了這些策略，以及推進HBV治愈所必需的臨床方法。

三、乙型肝炎治愈的策略

(一)在不殺死被感染細胞的情況下治愈HBV感染 自從發現HBsAg以來，已經過去了50多年。2012年HBV入胞受體NTCP的發現徹底改變了我們體外研究從感染到出胞的HBV復制周期的能力，必須解決我們對HBV復制周期和宿主免疫反應的理解中的重要差距，從而利用復制周期中的漏洞來治愈感染。

靶向cccDNA微染色體庫，消除cccDNA將是治愈慢性HBV感染最直接和有效的策略。目前的抗病毒藥物不能消除cccDNA。細胞因子給藥，包括α-干擾素，可以誘導APOBEC依賴的病毒脫氧核糖核酸脫氨作用，這一觀察引起了關于這是否會導致受感染肝細胞中cccDNA顯著減少的熱烈討論[4]。直接靶向cccDNA的方法 (如CRISPR/Cas9或其他基因編輯方法) 在實驗室研究中已顯示出有希望的結果，但包括肝細胞遞送、非靶向效應,以及它們也切割染色體整合的HBV基因從而引發染色體重組的不可預測后果的可能性等問題需要仔細考慮。由于這些潛在的危險和困難，必須進一步探索針對病毒或宿主蛋白質的方法，這些蛋白質對cccDNA的形成、穩定性和表達(如HBx)至關重要。對cccDNA產生、維持和周轉的基本生化、細胞和生理基礎的研究勢在必行，因為消除cccDNA是唯一有可能最終安全、持久地治愈HBV感染的策略。

由于在急性或慢性感染的自發或治療誘導的緩解控制過程中沒有完全根除cccDNA，因此在藥理學上不可能完全根除cccDNA。在大部分cccDNA被消除后，剩余的cccDNA池的轉錄沉默或者抗體介導的病毒從剩余的受感染細胞傳播的預防可能也是必要的。cccDNA表達的轉錄控制可以通過靶向HBx蛋白來實現，這對于cccDNA的表達或穩定性至關重要。因此，必須更深入地了解HBx、HBc和其他病毒蛋白在控制cccDNA同源狀態中的作用。Smc5/6復合物是宿主限制因子，在缺乏HBx蛋白的情況下抑制cccDNA的表達[5]。最近發現，HBx通過劫持含有細胞DDB1的E3泛素連接酶以靶向Smc5/6復合體進行降解來促進cccDNA轉錄[5]。因此，針對HBx-DDB1結合相互作用的治療方法也值得研究。轉錄后控制cccDNA或整合的HBV基因表達可以使用核糖核酸干擾來實現；目前正在努力實現這一目標，并取得了可喜的成果。還迫切需要開發原位、單細胞、單分子、活細胞分析，以可視化cccDNA的定位和運輸，以及cccDNA依賴的替代報道細胞系統，用于高通量篩選cccDNA抑制劑。

(二)誘導免疫控制以安全消除HBV感染細胞 先天免疫應答和適應性免疫應答的復雜相互作用對病毒清除至關重要，這些應答的失敗可能導致肝臟疾病。CD8+ T細胞是消除病毒的主要效應細胞，通過細胞溶解和非細胞溶解效應發揮功能。然而，保護性免疫需要足夠的CD4細胞活性和中和抗HBV包膜抗體的產生。研究者已做出重大努力，將急性感染HBV清除的有效綜合反應與慢性乙型肝炎患者觀察到的免疫應答失調進行比較。這些知識已帶來了第一代免疫療法，第二代治療性疫苗的開發也進入了I期和II期臨床試驗。

1．當前慢性HBV感染的免疫療法

在動物模型和HBV感染患者中進行的研究已經確定了可以作為治療目標的免疫調節的關鍵點。注射靶向Toll樣受體或RIG-1的配體可抑制HBV小鼠模型中的病毒復制。這一觀察結果導致了針對TLR-7[6]、TLR-8和RIG-1[7]的藥物開發，以用于慢性HBV感染患者。大量實驗表明，阻斷抑制受體可以增強HBV特異性T細胞在體外和體內的擴增和功能。這推動了PD1/PDL1抗體在慢性HBV感染患者的I期研究中的應用。此外，IL-12似乎對恢復慢性感染中的T細胞擴增和功能至關重要。因此IL-12和誘導它的佐劑被納入新一代慢性HBV治療性疫苗。

2．HBV介導的T細胞耗竭和恢復機制

HBV持久性與CD8+ T細胞耗竭(在較小程度上)和病毒逃逸有關。持續暴露于高抗原負荷和肝細胞抗原呈遞在CD8+ T細胞耗竭中起關鍵作用。抑制性受體(主要是PD-1)的表達、氨基酸(如精氨酸和色氨酸)的耗竭和線粒體的改變導致了T細胞功能障礙[8]。此外，CD4+ T細胞輔助活性、免疫抑制細胞因子、調節性T(Treg)細胞、粒細胞髓源性抑制細胞和自然殺傷細胞的缺乏也導致CD8+ T細胞衰竭[9]。然而，這些不同機制對T細胞衰竭的相對貢獻還沒有很好的描述，應該積極研究。此外，功能性T細胞修復是否可能，如果可能，HBV控制需要多少程度的T細胞修復，還沒有完全了解。了解這些內容將可以完善我們恢復T細胞功能和改善免疫療法的目標。另外，需要更好地理解抑制受體(如PD-1、CTLA-4、Tim-3)在疾病不同階段的相對貢獻，以確定最有可能受益于檢查點阻斷療法的患者群體。

3．應重視疾病自然史中的B細胞

抗HBV抗體被用作解決HBV感染的生物標志物，但B細胞和抗體對慢性HBV感染的自然史和解決方案的影響，或對慢性HBV感染血清轉換的影響尚未得到充分研究。B細胞可以產生免疫抑制性細胞因子IL-10，但它們的耗竭也可以導致已解決感染的患者和慢性乙型肝炎患者的臨床再激活。因此，需要解決與B細胞生物學、抗體特異性和中和反應相關的基本問題，以便將B細胞更有效地納入新的免疫治療方法。

4．準確測量感染肝細胞的頻率

慢性HBV感染免疫療法的主要安全性問題是引發暴發性肝炎。因此，了解受感染肝細胞的實際數量、表達病毒抗原的肝細胞數量以及在個體患者中可被破壞而不會導致肝功能受損的肝細胞數量非常重要。在短期內，需要更好的方法來定量活組織檢查或血清生物標志物中的感染肝細胞和整合肝細胞。能夠在醫學成像儀器上顯示受感染肝臟的體內診斷將是一個理想的長期目標。

5．臨床試驗中免疫監測技術的標準化

臨床試驗期間免疫監測技術的標準化是一項巨大但必需的任務。為了提高不同位點之間免疫監測的一致性，我們建議開發集中管理和廣泛可用的HBV肽庫和四聚體。與此相結合的是ELISPOT和流式細胞術染色的有效方案。這種方法將有助于促進持續的T細胞監測。

6．免疫療法的未來

目前在第一階段試驗中測試的檢查點抑制劑恢復HBV特異性CD8+ T細胞功能的潛力為HBV免疫療法提供了一個有希望的前景。然而，在未來的試驗中，還需要解決一些重要的問題，如T細胞的修復程度、抗PD-1抗體的劑量、根據生物標志物或疾病階段選擇可能有反應的患者，以及修復后的T細胞造成組織損傷的不良反應風險。在這種情況下，同樣重要的是確定聯合治療的療效。例如，不同抗病毒治療或治療性疫苗接種的檢查點抑制劑，這在臨床前動物模型中已被證明是有效的[10]。針對先天免疫的治療，用模式識別受體激動劑將抗病毒功效與炎癥分開可以提高它們的治療指數。除了完善免疫療法，推進抗病毒免疫工程的策略也有希望。T細胞受體和嵌合抗原受體基因療法規避了修復的需要[11]。然而，是否需要長期植入針對HBV的基因工程T細胞，以保持對從逃避清除的受感染細胞中傳播的病毒的控制，還有待解決。這些都是在聯合治療的背景下，應考慮和研究的免疫治療策略。基于互補作用機制合理配合使用抗病毒和免疫治療藥物，有望確保有效的抗病毒作用，消除感染肝細胞，提高HBV感染治愈率。

四、促進HBV感染治愈的綜合臨床研究

應建立一個已經獲得恢復的HBV感染患者血清樣本庫，包括HBsAg清除患者和免疫控制(抗-HBs)患者，并在緩解前提供適當的匹配對照，供全球研究人員使用。研究者還迫切需要類似于艾滋病毒領域的HBV相關材料的集中儲存庫，使HBV研究人員能夠方便地在全球范圍內獲取。

五、結論

現在是為全球受HBV影響的2.57億人開發和實施一種安全、可支付、可廣泛獲得的慢性乙型肝炎治愈方法的時候了。針對cccDNA庫并以安全和持久的方式刺激宿主免疫反應的新研究計劃必須成為研究人員、基金會和政府的高度優先事項。應竭盡全力支持美國國立衛生研究院最近對HBV或艾滋病毒/HBV免疫學、病毒學和治療學項目的R01呼吁。ICE-HBV力求通過促進與研究人員(HBV領域內外)、臨床醫生、制藥行業和一系列利益攸關方(包括受慢性乙型肝炎影響的社區)的合作伙伴關系來實現其目標，在全球范圍內努力發現、開發、測試和實施HBV治愈戰略，以幫助確保WHO到2030年消除HBV作為公共健康威脅的目標得以實現。