SEPT9基因在人肝細胞癌侵襲轉移中的作用

鄧沖 郭德良 謝雄偉

肝癌是我國發病率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅國民的身體健康[1]。由于肝癌具有很強的侵襲性和轉移性，如何降低肝癌的侵襲和遷移，抑制腫瘤細胞的增殖是臨床一致探究的問題[2]。SEPT 9基因是GTPase活性保守基因Septin的重要成員之一[3]，參與細胞分裂、胞內轉運、細胞調控等多種生理調節[4-5]。近年來的研究顯示，SEPT 9蛋白的高表達與腫瘤的發展密切相關，臨床已將其作為多種惡性腫瘤早期篩查的重要標志物[6-7]，但關于SEPT 9基因如何調控腫瘤細胞增殖、轉移的研究尚無明確報道，因此本文通過構建SEPT 9的靶向shRNA，沉默該基因的表達，分析其對肝癌細胞增殖侵襲能力的影響，為今后肝癌靶向藥物的開發提供基礎研究參考。

材料與方法

一、主要試劑

肝癌HepG2、Bel-7402、MHCC97、Hep3B、Huh-7細胞購于ATCC，DMEM培養基、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶、嘌呤霉素等(上海生工生物股份有限公司；中國)；EDU、MTT(Sigma公司；美國)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司；中國)；HIF-1α、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、β-actin等一抗蛋白(Santa Cruz公司，美國)；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗(Thermo公司，美國)；SEPT9陰性對照病毒(SEPT9-NC)、SEPT9靶向shRNA(靶向序列為5′-GGCAGCCCATCATGAAGTTCA-3′)購于上海吉瑪公司；細胞裂解液、ECL化學發光試劑及其他試劑、耗材(北京索萊寶科技有限公司, 中國)。

二、主要設備

CO2培養箱(SanYo公司，日本)，DNM-9606酶標分析儀(北京朗普新技術有限公司 中國)；EVOS FL 型全自動智能成像系統(Thermo，美國)；濕轉儀(AB公司，美國)，電泳儀(Bio-red，美國)，凝膠成像系統(DNR公司，以色列)；XD-202倒置顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)；其他儀器購于德國eppendorf公司。

三、細胞培養

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養液培養肝癌HepG2、Bel-7402、MHCC97、Hep3B、Huh-7細胞，培養條件為37℃，5% CO2。隔天換液一次，細胞融合度達到85%以上時進行傳代培養，三次傳代后進行實驗檢測。

四、SEPT9蛋白高表達細胞系篩選

收集對數生長其的細胞106個，提取腫瘤組織的總蛋白，酶標儀490 nm波長條件下進行蛋白定量。12% SDS-PAGE電泳分離，采用濕轉法將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，4℃條件依次加入封閉液孵育2 h，SEPT9抗體孵育過夜(稀釋比例均為1∶1 000)，二抗孵育2 h(稀釋比例均為1∶5 000)。用ECL化學發光試劑顯色，在凝膠成像系統檢測分析蛋白條帶，蛋白表達定量分析用Image J圖像分析軟件對條帶進行分析，內參采用β-actin。篩選SEPT9蛋白高表達細胞系，用于后續實驗。

五、慢病毒轉轉染

取對數生長期的SEPT9蛋白高表達細胞，調整細胞濃度為1×105/mL，2 mL/孔接種于6孔板，37 ℃,5% CO2條件下，待細胞生長覆蓋度達到50%時進行慢病毒感染，按照試劑操作說明書要求，進行慢病毒轉染，對照組加入20 μL培養基；陰性對照組加入20 μL SEPT9陰性對照病毒(SEPT9-NC，滴度2×108TU/mL)；抑制組加入6 μL SEPT9干擾病毒(SEPT9-shRNA：滴度9×108TU/mL)以及2 μL的polybrene(5 μg/μL)，轉染過夜后(約16 h)每天更換新鮮培養基。培養5 d后向培養基中加入終濃度為2 μg/mL的嘌呤霉素進行耐藥細胞株的篩選，westernblot鑒定病毒轉染效果，將轉染成功的細胞用于后續實驗。未經病毒轉染的細胞為對照組，轉染空病毒細胞(SEPT9-NC)為陰性對照組，轉染抑制基因病毒(sh-SEPT9)為實驗組。

六、細胞增殖檢測

取對數生長期的對照組、陰性對照組、實驗組細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL，100 μL/孔接種于96孔板，37 ℃, 5% CO2條件下，過夜培養(約16 h)過夜培養，根據EdU染色試劑盒說明書，檢測細胞增殖。完全培養基稀釋EdU溶液，作用濃度為10 μM，每孔加入100 μL，孵育4 h后棄培養基，PBS清洗兩次，多聚甲醛固定，Apollo染色，立即檢測或用抗熒光淬滅封片后，保存檢測。

七、細胞侵襲實驗

在Transwell小室中進行。取5 μg 纖粘連蛋白用移液器均勻的涂抹在小室內的PVPF聚碳酸濾膜外表面；同樣的操作方式在膜的內側表面涂5 μg matrigel。調整細胞濃度，每室分別接種2×105細胞對照組、陰性對照組、實驗組細胞，設置3個復孔；37 ℃, 5% CO2溫箱培養4 h。PBS清洗三次并去除小室中膜內側表面多余的細胞，多聚甲醛進行固定；400倍顯微視野下隨機選取10個視野, 倒置顯微鏡下采用雙盲計數法統計膜下表面的細胞數目平均值。實驗重復檢測三次。

八、劃痕遷移實驗

將劃痕實驗插件置于24孔板，取對數生長期的對照組、陰性對照組、實驗組細胞，調整細胞濃度為5×105個，37 ℃, 5% CO2條件下培養過夜(約16 h)。小心移去劃痕實驗插件，用完全培養基潤洗3次，加入10 μM絲裂霉素，繼續培養2 h，更換新鮮完全培養基，顯微鏡下拍照，時間點為0時，繼續培養24 h拍照分析細胞的遷移情況。

九、westernblot檢測細胞蛋白表達

取對數生長期的對照組、陰性對照組、實驗組細胞，細胞量為5×105個于1.5 mL離心管，westernblot操作方法參見1.2.2，提取細胞蛋白，分析沉默SEPT9蛋白后對肝癌細胞HIF-1α、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF、Vimentin, N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達影響，蛋白表達定量分析用Image J圖像分析軟件對條帶進行分析，內參采用β-actin。

十、統計學分析

結 果

一、SEPT9高表達細胞系篩選

結果如圖1所示，通過對5種肝癌細胞系HepG2、Bel-7402、MHCC97、Hep3B、Huh-7等檢測發現，SEPT9蛋白在各細胞系均有表達，蛋白表達定量分析顯示，HepG2細胞中的表達量相對較高。因此本文選擇HepG2細胞為研究對象，研究沉默SEPT9基因表達對肝細胞癌侵襲轉移的影響。

圖1 SEPT9蛋白在不同肝癌細胞系中的表達

二、慢病毒轉染結果

結果如圖2所示，與對照組相比，陰性對照組細胞SEPT9蛋白表達沒有顯著變化(P>0.05)，實驗組HeGp2細胞SEPT9蛋白表達顯著降低，差異統計學分析有意義(P<0.05)。多次傳代培養后westernblot檢測顯示，通過病毒轉染所構建的SEPT9蛋白低表達HeGp2細胞株性質穩定，能夠用于后續實驗步驟。

圖2慢病毒轉然sh-SEPT9對肝癌HeGp2細胞SEPT9表達的影響 與對照組相比：***P<0.001

三、SEPT9對肝癌HeGp2細胞增殖的影響

結果如圖3A所示，與對照組相比，SEPT9沉默后HeGp2細胞的增殖能力明顯受到抑制，差異統計學分析有意義(P<0.05)。Western blot實驗結果如圖3B所示，SEPT9沉默后HeGp2細胞Ki67和PCNA的表達明顯受到抑制，差異統計學分析有意義(P<0.01)，表明SEPT9沉默后HeGp2細胞Ki76和PCNA蛋白表達明顯受到抑，增殖能力顯著降低。

四、SEPT9對肝癌HeGp2細胞侵襲能力的影響

結果如圖4A所示，對照組侵襲細胞數為(108.69±15.21)個，HeGp2-SEPT9-NC組侵襲細胞數(108.69±15.21)個，與對照組相比，差異統計學分析無意義(P>0.05)，SEPT9-shRNA轉染組侵襲細胞數顯著減少為(45.23±7.32)個，與對照組相比，差異統計差異統計學分析有意義(P<0.05)。Western blot實驗結果如圖4B所示，SEPT9沉默后HeGp2細胞Vimentin, N-cadherin 的表達明顯降低，E-cadherin的表達顯著增強，差異統計學分析有意義(P<0.05)；表明sh-SEPT9能夠通過下調HeGp2細胞Vimentin、N-cadherin的表達，上調E-cadherin的表達水平，降低細胞的侵襲能力。

五、SEPT9對肝癌HeGp2細胞遷移能力的影響

結果如圖5A所示：與對照組相比：HeGp2-SEPT9-NC組細胞的遷移能力無明顯變化，差異統計學分析無意義(P>0.05)，HeGp2-SEPT9-shRNA組細胞的遷移明顯降低，差異統計學分析有意義(P<0.05)。Western blot實驗結果如圖5B所示，SEPT9沉默后HeGp2細胞HIF-1α、MMP-9及VEGF的表達量顯著降低，差異統計學分析有意義(P<0.05)；表明sh-SEPT9能夠通過下調HeGp2細胞HIF-1α、MMP-9及VEGF的表達，降低細胞的遷移能力。

圖3 sh-SEPT9對肝癌HeGp2細胞增殖的影響 與對照組相比：***P<0.001

圖4 sh-SEPT9對肝癌HeGp2細胞侵襲能力的影響 與對照組相比：***P<0.001

圖5 sh-SEPT9對肝癌HeGp2細胞遷移能力的影響 與對照組相比：***P<0.001

討 論

Septin基因是廣泛純在除植物以外的幾乎所有真核生物，是GTPase活性的保守基因，廣泛分布在人體的多個組織或細胞中，參與細胞分裂、胞內轉運、細胞調控等多種生理調節。SEPT 9基因是septin基因家族中重要成員之一，通過與細胞內微絲、微管及肌動蛋白相互作用，調控蛋白運輸。研究顯示SEPT 9蛋白在結腸癌、乳腺癌、肺癌及血液系統腫瘤等組織細胞中存在明顯的高表達情況[8]，SEPT 9蛋白達沉默后正常分裂將會受到抑制，易產生多核細胞。因此本文通過構建SEPT 9的靶向shRNA，研究沉默該基因的表達，對肝癌細胞增殖侵襲能力的影響。

通過對肝癌細胞SEPT 9蛋白表達檢測顯示，HeGp2細胞表達量相對較高，本文通過慢病毒轉染，沉默HeGp2細胞SEPT 9蛋白表達，結果顯示SEPT 9-shRNA轉然后，HeGp2細胞SEPT 9蛋白表達顯著降低，多次傳代后檢測發現，SEPT 9-shRNA對HeGp2細胞SEPT9蛋白沉默作用能夠穩定遺傳，表明本文構建的HeGp2-SEPT 9-shRNA細胞系成功，能夠用于后續課題的研究。

通過EdU染色[9]檢測發現，與對照組相比，SEPT9沉默后HeGp2細胞的增殖的數量明顯減少，增殖能力顯著降低(P<0.05)。Western blot對SEPT9沉默后HeGp2細胞Ki67和PCNA的表達分析顯示，與對照組相比，SEPT 9-shRNA組細胞Ki67和PCNA的表達量顯著降低(P<0.05)。由于沉默細胞SEPT9蛋白表達后，能夠抑制細胞的有絲分裂，而Ki67是一種核抗原[10]，PCNA細胞有絲分裂間期DNA合成所必需的一種核蛋白[11]，均參與細胞有絲分裂，其活性與細胞增殖能力密切相關。因此沉默HeGp2細胞SEPT9蛋白表達后，細胞的增殖受到抑制，分裂能力降低，造成Ki67和PCNA蛋白的表達量顯著降低。

上皮-間葉轉化(EMT)是發生在胚胎時期的生理過程[12]，通過破壞細胞的細胞間連接，促進細胞的侵襲。這可能是肝癌細胞具有較強的組織侵襲的原因，本文通過transwell小室實驗發現，與對照組相比，SEPT9沉默后HeGp2細胞侵襲量顯著減少(P<0.05)；Western blot實驗結果顯示，SEPT9沉默后HeGp2細胞Vimentin, N-cadherin 的表達明顯降低，E-cadherin的表達顯著增強(P<0.05)。由于細胞發生EMT過程中，非上皮的黏附分子如 N-cadherin、Vimentin能夠能提供微管及肌動蛋白所沒有的彈性，改變細胞的靈活和形態，穿透上皮細胞的間隙，實現細胞的組織侵襲和遷移[13-14]。沉默SEPT9基因表達后，HeGp2細胞的Sentiment, N-cadherin的表達顯著降低，表明其EMT機制顯著受到抑制，從而降低HeGp2細胞的侵襲能力。

本文通過劃痕實驗也對SEPT9沉默后肝癌HeGp2細胞的遷移能力進行分析，結果顯示，與對照組相比：SEPT9沉默后，HeGp2細胞遷移能力明顯降低(P<0.05)。Western blot結果顯示，SEPT9沉默后，HeGp2細胞HIF-1α、MMP-9及VEGF的表達量顯著降低(P<0.05)。這是由于HIF-1對氧氣的濃度依賴性很強，在低氧環境下腫瘤細胞通過刺激HIF-1α的表達，促進VEGF的表達，誘導血管新生，增強腫瘤組織中氧分和營養的供給，同時也為轉移提供便利[15]。MPP-9作為主要的基質金屬蛋白酶，能夠破壞腫瘤細胞遷移的組織學屏障[16]，表明沉默SEPT9蛋白表達能夠抑制細胞HIF-1α、MMP-9及VEGF的表達，降低營養供給和血管新生，從而抑制HeGp2細胞的遷移。

綜上所述，SEPT9基因高表達能夠增強肝癌HepG2細胞的增殖能力，通過EMT機制，促進肝癌HepG2細胞的侵襲和轉移。