環指蛋白Efp對人肝細胞增殖及侵襲力的作用機制

周東 何艷平 李恒平 黃衛東

環指蛋白Efp(estrogen-responsive ring finger protein，Efp)是RBCC(Ring-finger B-box coild-coil)家族的主要成員，其生物結構包括一個環指區域、兩個B盒區域、一個螺旋狀卷曲區域以及一個C末端的SPRY區域[1]。Efp是雌激素受體(estrogen receptor)的靶點基因，在生物體內子宮、腎臟、腦及肝臟等多器官中表達，同時與細胞多種生物功能調節有關，其中包括細胞周期、凋亡及腫瘤生成等[2]。目前已有研究發現，Efp與腫瘤細胞的異常病理活動密切相關，Efp基因對子宮內膜癌細胞的生長有重要的調節作用[3]。但是，目前對Efp與肝癌細胞的相關研究鮮有報道，其相關的調控機制尚未清楚。本研究采用RNA干擾對人肝細胞株Bel7404進行Efp基因沉默，探討Efp基因沉默對肝癌細胞Bel7404的增殖及侵襲力的作用機制，以期為相關的臨床治療提供新的可能性。

資料與方法

一、材料與試劑

人肝癌細胞株Bel7404購買自美國菌種保藏中心。DMEM培養基和胎牛血清均購買自美國Hyclone公司。脂質體LipofectaminTM 2000的轉染試劑盒購買自美國Invitrogen公司，質粒DNA提取純化試劑盒購買自美國TIANGEN公司。兔抗鼠多克隆抗體Efp購買自Santa Cruz公司，兔抗鼠多克隆抗體CyclinE和CDK2均購買自中國Proteintech公司。細胞增殖活性檢測MTT試劑盒、Transwell小室和BCA蛋白定量試劑盒均購買自中國Beyotime公司。

二、試驗方法

(一)Efp干擾質粒的設計與合成 根據GenBank中Efp基因序列，使用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)設計軟件，合成的siRNA序列為5’-GGUCCACCUGAUGUAU-AAGCUUAUACAUCAGGUGGAC-3’；同時陰性對照鏈為3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’。siRNA合成交由武漢晶賽生物工程公司完成。

(二)細胞培養 將冷存與液氮中的人肝癌細胞株Bel7404復蘇后，接種在含有100U/ml的青霉素與100ug/mL的鏈霉素、10%胎牛血清以及DMEM培養基的6孔板中，然后將其置于37℃的細胞培養箱中，2-3天進行細胞換液，待細胞長滿至80%以上，采用胰蛋白酶進行消化傳代后接種在新的培養皿中。

(三)細胞轉染及分組 本研究設立對照組(Control)和轉染組(siRNA)，對照組采用陰性對照鏈的RNA進行轉染，轉染組再用Efp的siRNA干擾質粒進行轉染，轉染時每組細胞設6個復孔，細胞鋪滿孔內80%以上后采用脂質體LipofectaminTM2000方法進行細胞轉染。轉染首先采用無血清DMEM培養基6 h，然后再將培養基換為10%胎牛血清后繼續培養48 h，其余過程均按照說明書指示進行。

(四)Western blot檢測蛋白表達 將兩組細胞加入蛋白裂解液后提取總蛋白，采用BCA方法檢測蛋白濃度后，將總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離、NC膜轉膜、5%牛奶封閉1 h后，分別進行Efp、CyclinE、CDK2和β-actin一抗4℃孵育過夜。次日進行TBST洗膜三次后，再加入二抗室溫孵育1 h，暗室加入ECL試劑盒顯影記錄結果。

(五)細胞增殖能力檢測 首先將細胞接種于96孔中，每孔約1×104個，待轉染細胞24、48和72 h時，每孔加入MTT液10 μL，然后再將培養皿置于細胞培養箱孵育3 h后去除上清液，加入DMSO液體孵育10 min后進行酶標儀檢測各孔吸光度，計算每組細胞的增殖能力。

(六)細胞侵襲力檢測 將轉染前后的Bel7404細胞接種無血清DMEM上室后，將含有10%胎牛血清的DMEM培養基置于下室，待細胞培養24 h后取出小室，此刻細胞已經遷移至上室膜的底面，將小室進行4%多聚甲醛固定15 min后，采用結晶紫染色5～8 min，最后將其置于顯微鏡下隨機選取5個視野進行細胞數量定量分析。

(七)統計學處理 采用SPSS 19.0 統計軟件分析，兩組間的比較采用t檢驗，計量資料均采用均數±標準差表示，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、轉染siRNA對Efp蛋白表達的影響

圖1結果表明，人肝癌細胞株Bel7404的siRNA組中Efp蛋白表達為0.32±0.05，較對照組的1.00±0.00明顯下降，且差異有統計學意義(圖1，P<0.05)，此結果提示siRNA對人肝癌細胞株Bel7404體外轉染成功，細胞中的Efp基因表達可被干擾siRNA沉默，具體見圖1。

圖1 轉染后Efp蛋白的表達；A: Bel7404細胞各組中Efp蛋白表達

二、轉染siRNA質粒對細胞增殖及其機制的影響

圖2結果表明，人肝癌細胞株Bel7404中siRNA組的細胞增殖率在24、48和72h時為0.087±0.010、0.107±0.013以及0.120±0.010，分別較對照組的增殖率0.112±0.012、0.134±0.011以及0.163±0.010明顯下降，且差異有統計學意義(圖2A，P<0.05)。該結果提示肝癌細胞株在沉默Efp后可明顯抑制細胞增殖能力，而且呈時間依賴性，為進一步深入研究Efp對細胞增殖的作用機制，本研究進而檢測細胞周期標志蛋白CyclinE和CDK2的蛋白表達。結果表明，siRNA組中細胞的CyclinE和CDK2蛋白表達為0.47±0.04和0.27±0.12，分別較對照組明顯下降，且差異有統計學意義(圖2B，P<0.05)，此結果提示Efp可通過抑制細胞周期蛋白CyclinE和CDK2的表達進而阻礙肝癌細胞株的過度增殖，具體見圖2。

三、轉染siRNA質粒對細胞侵襲能力的影響

Transwell結果表明，人肝癌細胞株Bel7404的siRNA組中細胞侵襲率為0.3384±0.0492，顯著低于對照組的0.7057±0.0836，且差異有統計學意義(t=5.35，P<0.05)，此結果提示Efp可明顯抑制人肝癌細胞株的過度侵襲能力。

圖2轉染后Efp對Bel7404增殖及其機制的影響 A: 各組Bel7404細胞中不通時間點的增殖能力；B: Bel7404細胞各組中CyclinE和CDK2蛋白表達；*與對照組(Control)比較，P<0.05，差異具有統計學意義

討 論

Efp基因作為機體內泛素連接酶E3調節機體內細胞的生長、增殖及分化等生物功能[4]。已有研究證明Efp可調節腫瘤的生長與轉移，但是主要的研究多集中在乳腺癌或子宮內膜癌的病理活動或預后發展[2]，關于Efp在肝癌細胞中的表達及調控機制研究較少。

研究表明Efp沉默可明顯抑制子宮內膜癌細胞血管生成，進而抑制子宮內膜癌的增殖及遷移[2]。而肝細胞癌癥多為血管富集性腫瘤，其腫瘤的發生、發展及轉移都與血管生成有著緊密的聯系[5-6]。根據肝臟腫瘤與血管生成緊密相連的病理機制以及過往的研究的結果，本研究通過采用Efp基因沉默，進一步研究其余肝癌細胞的增殖及侵襲力的關系。本研究選取人肝癌細胞株Bel7404作為研究對象，在此基礎沉默Efp表達，進一步檢測其對細胞增殖及其侵襲力的影響機制。

本研究結果顯示，Bel7404細胞在轉染siRNA后，Efp蛋白表達明顯下降，這一結果說明病毒已轉染至細胞中并成功使Efp基因沉默。而進一步實驗發現，Efp基因沉默后24、48以及72 h Bel7404的細胞增殖率明顯降低，并且呈時間依賴性。同時，實驗研究結果也發現沉默后Efp可明顯抑制細胞株的侵襲能力。關于細胞增殖作用機制，其中細胞周期標志蛋白CyclinE和CDK2是細胞周期的關鍵調控因子，主要調控細胞由G1期過渡至S期，最終促進細胞增殖[7]。結合相關理論及前期實驗，為探討Efp對人肝癌細胞增殖及侵襲力的具體機制，本研究通過檢測細胞蛋白表達，發現Efp基因沉默后可明顯降低細胞中周期蛋白CyclinE和CDK2的表達，這可能是Efp調控肝癌細胞增殖的作用機制。而Efp可作為泛素連接酶E3，特異識別相關蛋白后促進其在泛素途徑內降解。根據我們研究結果和以往的研究，我們認為Efp主要是通過靶向識別細胞周期標志蛋白CyclinE和CDK2后，促進細胞周期蛋白在肝癌細胞內的降解，進而通過阻滯細胞從G1期過渡至S期以達到抑制肝癌細胞的增殖及侵襲能力的目的。

綜上所述，本研究通過基因沉默Efp驗證其通過加速CyclinE和CDK2的降解，進一步可調節人肝癌細胞株Bel7404的增殖及侵襲能力，為肝癌治療開辟新的靶點，同時為后續研究提供了很多理論依據。