新型糖肽類抗生素B7011對細菌感染小鼠敗血癥的體內(nèi)抗菌作用研究

朱珍真 郎麗巍 王紅艷 朱姍薇 韓曉彤 張翠英 曹艷茹 魏振滿,*

(1 中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心藥學部藥物試驗中心，北京 100039；2 成都雅途生物技術(shù)有限公司，成都 610041)

隨著細菌耐藥程度日趨上升，其中葡萄球菌及腸球菌都具有較高水平的耐藥性[1-2]，由其引起的敗血癥、急性肺炎以及皮膚和軟組織感染等嚴重感染疾病，增加了患者的痛苦[3]，針對此類感染，研發(fā)新型抗生素已經(jīng)迫在眉睫。

目前，萬古霉素、利奈唑胺、達托霉素等抗生素是臨床上治療耐藥菌感染的常用藥。但是隨之而來的是細菌對這些藥物的的敏感性呈逐年下降的趨勢，再加之萬古霉素、利奈唑胺等藥物具有較大的毒副作用，使其在臨床上的應用受到一定程度的限制[4-5]。

B7011是成都雅途生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)的半合成第二代糖肽類抗生素，本研究的前期試驗中，我們檢測了B7011和萬古霉素對目標菌株的體外抗菌活性，測得B7011對MSSA、MRSA、VRE的MIC值分別為≤0.125、≤0.125和0.015μg/mL，均顯著低于萬古霉素(1、1和＞256μg/mL，表明B7011具有較好的體外抗菌活性。本研究以VRE、MSSA和MRSA感染敗血癥小鼠為動物模型，研究B7011對敗血癥小鼠的保護作用。

1 試驗材料

1.1 試驗藥品

試驗藥：B7011，成都雅途生物技術(shù)有限公司研制；批號：121210-2，效價：97%；對照藥：萬古霉素(vancomycin)，美國禮來制藥公司研制；批號：c060864，效價：100%。

1.2 試驗菌株

革蘭陽性菌3株。其中MSSA為標準菌株，其菌號：ATCC29213；而MRSA以及VRE為臨床分離的耐藥菌株；以上菌株均由衛(wèi)生部臨床檢驗中心微生物室提供。

1.3 培養(yǎng)基與孵育條件[6-7]

葡萄球菌：恒溫35℃，在M-H培養(yǎng)基中孵育18h；屎腸球菌：恒溫35℃，在含有5%綿羊血的M-H培養(yǎng)基中孵育20～24h。

1.4 試驗動物

ICR種小鼠，體重控制在18～22g，性別見具體實驗方法，由北京市斯貝福試驗動物有限公司提供；動物合格證號：SYXK(京)2011-0004；動物飼養(yǎng)地點：原中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院實驗技術(shù)保障研究中心動物實驗室，實驗室許可證號：SYXK(軍)2012-0010。

1.5 保護劑

高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司，生產(chǎn)日期：2013年4月8日。用純化水配置成濃度為5%的混懸液，高壓后放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗方法

2.1 增毒實驗方法[6-8]

為了得到可導致實驗動物80%～100%死亡的菌濃度，即最小致死劑量(minimum lethal dose,MLD)菌濃度，需要對致病菌進行增毒。增毒方法為：于試驗前1d將試驗用菌接種于10mL MH液體培養(yǎng)基中，按照“1.3項”所列要求進行培養(yǎng)。用保護劑將培養(yǎng)好的菌原液做10-1、10-2倍稀釋，并對雄性ICR小鼠進行腹腔注射，注射劑量為每只0.5mL，注射后觀察。在無菌條件下解剖感染后剛死亡或瀕死小鼠，取心臟血涂于MH固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)細菌，再以此菌繼續(xù)感染小鼠，按此方法重復實驗2～3次，得到MLD菌濃度。

2.2 免疫低下小鼠的建模[6-9]

由于VRE毒力較弱，故用腹腔注射VRE菌液造成小鼠急性敗血癥時，需在感染前先將試驗小鼠制備成免疫低下小鼠，以提高感染的成功率。制備方法為：分別于第1天和第4天，對ICR小鼠進行一次皮下注射環(huán)磷酰胺，注射劑量為200mg/kg/次，通過此方法，可以使小鼠的白細胞值降至100～150×109/L，末次注射環(huán)磷酰胺16h后再腹腔注射感染VRE菌液，可以保證模型對照組的死亡率在80%以上。

2.3 藥液稀釋方法[10]

采用孫瑞元介紹的低比值系列稀釋方法，即相臨兩個劑量組的藥液以0.65～0.7倍進行稀釋，一共稀釋6～7個濃度。藥物劑量可以通過預實驗數(shù)據(jù)獲得。在正式試驗中，最高藥物劑量應盡量保證感染鼠存活率達到70%～100%，最低藥物劑量應盡量使得感染鼠的存活率低于30%。

2.4 ED50(50%有效劑量)動物保護試驗[6-7]

將體重為18～20g的ICR種小鼠進行隨機分組，每組10只，雌雄各半。禁食后，取5%高活性干酵母混懸液配制的MLD濃度的菌液，按每只0.5mL的劑量，以腹腔注射的方式建立感染模型。注射后1h，通過尾靜脈注射給予不同濃度的藥物，劑量為每只0.2mL。感染后連續(xù)觀察7d，記錄各給藥組、陽性對照組以及MLD和0.1 MLD感染組小鼠死亡數(shù)，將給藥劑量和對應的小鼠死亡數(shù)導入DAS 2.1.1軟件進行半數(shù)有效劑量的運算，得到試驗藥和對照藥的ED50、ED5、ED95，以及兩藥藥效學參數(shù)比較P值結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 對MSSA致小鼠急性感染敗血癥模型的保護作用

B7011對MSSA-ATCC 29213致小鼠急性敗血癥模型的保護作用結(jié)果為：ED50、ED5、ED95值分別為0.722、0.468和1.115mg/kg。陽性對照藥萬古霉素對敏感菌所致敗血癥模型也有較好的保護作用，其ED50、ED5、ED95值分別為0.764、0.416和1.403mg/kg；比較兩藥的保護作用，統(tǒng)計結(jié)果P=0.645，提示差異無統(tǒng)計意義。表明B7011對MSSA所致小鼠急性敗血癥模型的體內(nèi)保護作用與陽性對照藥萬古霉素相似。具體數(shù)值見表1～2。

3.2 對MRSA致小鼠急性感染敗血癥模型的保護作用

B7011對MRSA- C118致小鼠急性敗血癥模型的保護作用結(jié)果為：ED50、ED5、ED95值分別為0.193、0.045和0.82mg/kg，陽性對照藥萬古霉素組的感染動物死亡數(shù)量明顯多于試驗藥組，其ED50、ED5、ED95值分別為：0.374、0.092和1.515mg/kg；比較兩藥的保護作用，統(tǒng)計結(jié)果P＜0.05，差異有統(tǒng)計意義，由此可見，針對耐藥菌感染所致的小鼠急性敗血癥模型，新型糖肽類抗生素B7011的體內(nèi)保護作用明顯優(yōu)于萬古霉素。具體數(shù)值見表1～2。

3.3 對VRE致小鼠感染敗血癥模型的保護作用

B7011對VRE-No.5所致小鼠急性敗血癥模型的保護結(jié)果為：ED50、ED5、ED95值分別為0.395、0.046和3.429mg/kg，而該致病菌對陽性對照藥萬古霉素產(chǎn)生了明顯的耐藥性，導致即使提高了萬古霉素的給藥劑量，但動物的死亡數(shù)量仍然較多。萬古霉素對VRE的ED50、ED5、ED95值分別為1.547、0.079和30.168mg/kg；兩藥統(tǒng)計學處理P值＜0.01，差異有統(tǒng)計意義。說明B7011對VRE所致小鼠急性敗血癥模型體內(nèi)保護作用明顯優(yōu)于萬古霉素。具體數(shù)值見表1～2。

4 討論

B7011是成都雅途生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)的半合成第二代糖肽類抗生素。與其他糖肽類抗生素相似，B7011的藥理作用為：與處于分裂期的細胞壁肽聚糖前體末端的氨基酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸結(jié)合，以此阻礙細胞壁的合成，從而起到抑制并殺滅細菌的作用[11-12]。不同的是，B7011在糖基側(cè)鏈中加入了一條飽和烴基鏈，長度為11個碳原子，這一脂肪鏈的引入起到了大幅增加B7011半衰期的作用，而且還有利于藥物分子與致病菌細胞膜的錨定，從而增加了B7011的抗菌活性。

前期的體外試驗結(jié)果表明B7011抗菌譜主要為革蘭陽性菌。本研究檢測了B7011和萬古霉素對目標菌株的體外抗菌活性，測得B7011對MSSA、MRSA、VRE的MIC值分別為≤0.125、≤0.125和0.015μg/mL，均顯著低于萬古霉素(1、1和＞256μg/mL)。

表1 對3株菌所致小鼠急性敗血癥模型各組給藥劑量及給藥后動物死亡數(shù)量表Tab.1 Drug dosage for acute septicemia induced by three strains of bacteria and mortality of animals after administration

表2 B7011及萬古霉素對革蘭陽性球菌所致小鼠敗血癥模型保護作用的藥效學參數(shù)Tab.2 Pharmacodynamic parameters of the protective effect of B7011 and vancomycin against systemic infections in mice caused by Gram-positive cocci

基于此，本研究開展了B7011體內(nèi)抗菌作用研究。利用臨床常見的革蘭陽性菌急性感染ICR小鼠來制備敗血癥動物模型，給與不同劑量的藥物，比較B7011和藥性對照藥萬古霉素對敗血癥小鼠的保護作用。從已完成的ED50動物保護試驗結(jié)果可以看出：B7011可以降低臨床常見致病菌急性感染的敗血癥小鼠的死亡數(shù)量，特別是對萬古霉素已經(jīng)產(chǎn)生耐藥的菌株，其保護作用尤為顯著。結(jié)合體外試驗數(shù)據(jù)，我們可以期待新型糖肽類抗生素B7011有望成為臨床上應用于耐藥菌感染的具有較好療效的藥物。目前該藥已成功申請臨床試驗批件，將對其安全性、有效性和藥動學特征等方面進行全面的研究與評估。