草莓生長素響應基因FvIAA17的克隆及表達分析

蘇麗艷

(西安文理學院 生物與環境工程學院,秦嶺野生觀賞植物研究中心, 陜西 西安 710065)

草莓(FragariaananassaDuch.)因味道鮮美，富含大量的維生素而廣受歡迎。近年來我國草莓種植面積不斷增長，栽植草莓具有可觀的經濟效益，然而草莓畸形果的形成直接影響草莓商品價值。果實發育受到生長素(Auxin)、脫落酸(ABA)、乙烯(Ethylene)、赤霉素(GA)等多種植物激素的共同調控，草莓作為呼吸非躍變型果實的典型代表，其發育及成熟過程主要受到生長素和脫落酸的調控[1]，激素之間的互作調控過程直接影響果實的品質，激素調控的失衡是形成草莓畸形的重要原因之一[2-3]。因此，了解生長素與脫落酸及兩者互作對草莓果實發育的調控機制，篩選重要的調控因子，對開展草莓分子生物學育種及優良草莓品種培養具有重要意義。

生長素信號的轉導受3個主要基因家族Aux/IAAs、SAURs 和GH3s 的調控[4]。生長素濃度較低時，Aux/IAAs與ARF(Auxin response factor)結合，抑制生長素響應基因的表達；生長素濃度較高時，生長素受體(TIR1/AFBs)與生長素結合后導致Aux/IAAs泛素化進而被26S蛋白酶體降解，使ARF從ARF-Aux/IAA聚合物中游離下來，從而激活生長素響應信號[5-7]。

近年來對Aux/IAAs 家族基因在植物發育過程中的功能研究越來越受到重視，其家族基因的功能不斷被發掘[8-11]。Aux/IAA家族基因典型的4個保守結構域，分別是Domain Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。Domain Ⅰ有轉錄抑制功能，具有一個LxLxLx典型基序；Domain Ⅱ對Aux/IAA 蛋白的穩定性起作用，核心序列為GWPPV；Domain Ⅲ和Ⅳ負責蛋白的二聚化，可與生長素響應因子ARF家族基因形成二聚體[12]。在擬南芥中的研究表明，大多數Aux/IAAs 家族成員大多與根的生長發育有關，如AtIAA28[13]、AtIAA19[14]、AtIAA14[15]等。水稻OsIAA9、OsIAA11對水稻側根的發育有重要調控作用[16-17]；馬鈴薯StIAA2下調表達使植株高度增加、葉柄表現出偏向下性、并降低了頂端葉原基生長的彎曲程度等[18]。目前，Aux/IAA家族基因已經在馬鈴薯[19]、大豆[20]、白菜[21]、木瓜[22]、油菜[23]等多種果蔬中被分離和鑒定。

關于Aux/IAA家族基因在果實發育過程中的功能研究主要以番茄為模式植物進行，抑制表達番茄SlIAA3蛋白使番茄植株對生長素的敏感性下降，從而表現出頂端優勢、葉片形態及乙烯可誘導表型的改變等[24]，抑制表達SlIAA9基因使植株表現出多種表型變化，如形成單葉，坐果過程提前發生[25]; 抑制表達Sl-IAA27后導致番茄果實變小[26]；而抑制表達Sl-IAA17，通過影響細胞的膨大過程使番茄果實增大[27]。而關于Aux/IAA家族基因在草莓發育過程中的功能研究進展緩慢。

鑒于此，本研究以森林草莓(Fragariavesca)為試驗材料，克隆得到森林FvIAA17基因，通過DNAMAN、ProtParam、TargetP、MEGA 5等生物信息學工具對其序列特征進行分析，同時利用實時熒光定量PCR對其表達特性進行了初步的探究，以期為深入研究該基因的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試材與處理

選用森林草莓為試材，材料種苗來源于西安市農業技術推廣中心，移栽種植于西安文理學院溫室大棚中，培養條件為溫度。采集成株盛期的根、莖、葉、花組織，果實取3個時期，即綠果(花后12 d)、1/2紅果(花后20～21 d)、紅熟果(花后25～26 d)，將植物材料用液氮冷凍，保存于-70 ℃冰箱備用。

取長勢良好的草莓幼苗，待其第5～6片葉子展開后，取地上部分分別置于蒸餾水、生長素(IAA，50 mg/L)、脫落酸(ABA，100 μmol/L)、IAA+ABA(終質量濃度分別為50 mg/L和100 μmol/L)溶液中，分別于處理后0，1，6，12 h取材。每個樣品3次生物學重復。試材液氮冷凍后存于-70 ℃冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 RNA提取試劑盒購于TIANGEN(北京)，按照說明書進行RNA提取，利用1%的瓊脂糖凝膠進行RNA完整性檢測；反轉錄試劑盒購自TaKaRa寶生物工程有限公司(大連)，根據試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.2FvIAA17基因的克隆 以草莓葉片cDNA為模板，用Primer 6.0設計IAA17基因特異性引物(表1)進行PCR擴增。PCR 反應條件為94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸40 s, 35個循環; 最后72 ℃延伸7 min。PCR 產物經回收、連接、轉化后，挑取陽性克隆子送往上海生物工程有限公司進行DNA測序。

1.2.3FvIAA17基因生物信息學分析 方法同文獻[28]。

1.2.4FvIAA17基因表達分析 利用Primer 6.0設計FvIAA17基因qPCR特異性引物(表1)，內參為草莓Fv18S，引物由上海生工合成。qPCR采用羅氏FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒。方法步驟參照說明書進行。每個樣品3次重復。試驗結果用2-ΔΔCT法對數據進行定量分析，同文獻[28]。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結果與分析

2.1 FvIAA17的克隆和序列分析

以草莓葉片cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR 擴增(圖1)。測序后得到約594 bp序列，分析后表明目標基因序列一致。FvIAA17基因編碼197個氨基酸。預測其分子質量為21.85 ku，等電點為7.56。

2.2 FvIAA17蛋白生物信息學分析

1.FvIAA17 基因克隆; M.M 2 000 bp Marker。1.Amplification of the FvIAA17 gene; M.M 2 000 bp Marker.

2.2.1FvIAA17基因啟動子序列分析 分析表明(表2)，FvIAA17啟動子區含有TATA框、CAAT框等調控真核基因轉錄的基本元件，同時還具有多種植物激素及逆境脅迫響應元件，如ABA、MeJA茉莉酸甲酯誘導響應、低溫、低氧脅迫元件等。

表2 FvIAA17啟動子順式作用元件分析Tab.2 The cis-elements in the promoter of FvIAA17

2.2.2FvIAA17基因同源序列比對及進化分析 利用DNAman軟件將FvIAA17與其他物種中同源性較高的氨基酸序列進行比對。結果顯示，FvIAA17的蛋白序列具有生長素誘導基因Aux/IAA家族典型的4個保守結構域(圖2)。據編碼FvIAA17的氨基酸序列并結合其他植物同源氨基酸序列，利用MEGA 5.0進行系統進化樹分析(圖3)。結果顯示FvIAA17基因與蘋果MdIAA1基因的親緣關系最近。

NaIAA17-L.煙草(XP_019229757.1)； PaIAA1.甜櫻桃(XP_021817959.1)； AtIAA17.擬南芥(NP_171921.1); CcIAA17.黃辣椒(PHU24404.1)；RcIAA1.蓖麻(XP_002517529.1)； StIAA17-L. 馬鈴薯(XP_006343103.2)；VaIAA17.赤豆(XP_017425536.1)；CsIAA1.甜橙(XP_006465436.1)；PpIAA1.桃樹(XP_007215971.1)；FvIAA17.草莓(XP_004302956.1)；SiIAA14.芝麻(XP_011081682.1)；PbIAA1.白梨(XP_009339009.1)；GaIAA16.樹棉(XP_017605091.1)；QsIAA17.栓皮櫟(POF06625.1)；JrIAA17-L.胡桃(XP_018847560.1)； MdIAA1. 蘋果(XP_008377585.1)；MnIAA17. 桑樹(XP_010110305.1)。黑色下劃線為FvIAA174個保守結構域。

NaIAA17-L.Nicotianaattenuate(XP_019229757.1); PaIAA1.Prunusavium(XP_021817959.1); AtIAA17.Arabidopsisthaliana(NP_171921.1); CcIAA17.Capsicumchinense(PHU24404.1); RcIAA1.Ricinuscommunis(XP_002517529.1); StIAA17-L.Solanumtuberosum(XP_006343103.2); VaIAA17.Vignaangularis(XP_017425536.1); CsIAA1.Citrussinensis(XP_006465436.1); PpIAA1.Prunuspersica(XP_007215971.1); FvIAA17.Fragariavesca(XP_004302956.1); SiIAA14.Sesamumindicum(XP_011081682.1); PbIAA1.Pyrus×bretschneideri(XP_009339009.1); GaIAA16.Gossypiumarboretum(XP_017605091.1); QsIAA17.Quercussuber(POF06625.1); JrIAA17-L.Juglansregia(XP_018847560.1); MdIAA1.Malusdomestica(XP_008377585.1); MnIAA17.Morusnotabilis(XP_010110305.1).The conserved domainⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ ofFvIAA17was marked by single black line.

圖2 草莓FvIAA17氨基酸序列和所選物種Aux/IAA家族基因氨基酸序列比對
Fig.2 Analysis of the FvIAA17 amino acid sequence and these selected Aux/IAA from other plant species

圖3 FvIAA17基因與其他植物Aux/IAAs基因進化關系分析Fig.3 Phylogenetic relationship based on FvIAA17 amino acid sequence and other plant Aux/IAAs

2.2.3 FvIAA17亞細胞定位、信號肽、跨膜結構分析及磷酸化位點預測 利用Cello對FvIAA17蛋白進行亞細胞定位預測(表3)，表中數值越大表明結果可信度越高。因此，FvIAA17蛋白定位于周質間(表3)，具體定位情況仍需試驗進行驗證確定。FvIAA17蛋白無信號肽，無跨膜結構；磷酸化位點進行預測結果表明，FvIAA17有18個Ser、15個Thr和2個Tyr。

表3 FvIAA17亞細胞定位預測Tab.3 The information in predicting FvIAA17 subcellular localization

2.3 FvIAA17基因在草莓不同組織中的表達分析

以草莓Fv18S為內參基因，通過RT-qPCR檢測發現，草莓中FvIAA17在草莓根、莖、葉、花、果實中均有表達，但相對表達量差異明顯，以目的基因在根中表達量為對照，其在綠果、莖和1/2紅果中表達量顯著增加，特別是在綠果和莖中表達量較高，分別比其在根中表達量高4.0，2.3倍(圖4)，可能與該基因在不同組織中的功能差異相關。

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖5同。Different small letters show significantly different at 0.05.The same as Fig.5.

2.4 外源激素處理對FvIAA17基因表達水平的影響

RT-qPCR檢測發現(圖5)，與無處理對照組相比，FvIAA17在IAA處理早期1，6 h受到強烈誘導呈上調表達，在處理后6 h達到最大表達量，而后隨著處理時間增長漸恢復正常水平；ABA處理草莓植株后，與對照組相比，FvIAA17的表達水平在處理1，6 h均呈顯著性下調趨勢，12 h后恢復正常水平；IAA+ABA處理后，FvIAA17基因表達模式與IAA處理趨勢相同，表現為先升高而后恢復，但上升的幅度有所下降，表明IAA和ABA聯合作用時，IAA的調控作用處于主導地位，IAA與ABA之間可能存在互作調控關系。

圖5 不同激素處理下FvIAA17相對表達量Fig.5 Relative expression of FvIAA17 gene under different hormone treatment.

3 結論與討論

草莓屬于薔薇科草莓屬，成熟過程中不形成乙烯合成高峰，屬于呼吸非躍變型果實。與呼吸躍變型果實相比，植物激素調控呼吸非躍變型果實成熟機理的研究發展緩慢。生長素是第一個被鑒定的植物激素，研究表明，生長素調控果實生長發育過程，特別是果實的膨大期，但對于果實的成熟有一定的抑制作用[29]。對草莓和葡萄成熟機制研究表明，生長素與ABA可能互作調控果實的成熟過程[30-31]，但二者互作的機制及關鍵的調控因子尚不清楚。生長素對草莓的花誘導控制及其授粉后果實的生長發育過程有重要調控作用，其分泌過多將導致草莓花芽分化異常、草莓畸形果等[32]。因此，生長素及其互作激素對草莓果實發育的調控機制研究，特別是解析關鍵調控因子的功能對通過分子育種手段培育優良草莓品種具有重要的指導意義。

本研究以森林草莓為材料，克隆得到FvIAA17基因全長，該基因CDS序列為594 bp，編碼197個氨基酸，其分子質量和等電點分別為21.85 ku和7.56。生物信息學分析可知，FvIAA17基因具有典型的Aux/IAA家族的4個保守區，進化樹分析表明，FvIAA17與蘋果的MdIAA1基因親緣關系較近。熒光定量PCR研究表明，FvIAA17基因在草莓的不同組織中均有表達，在綠果期果實中表達量最高，推測FvIAA17基因可能參與調控草莓果實早期的發育過程。外源激素IAA處理發現，FvIAA17基因在處理早期1,6 h受到強烈誘導呈上調表達，并在處理6 h后達到頂峰，而后漸恢復正常水平；ABA處理草莓植株，處理后1，6 hFvIAA17呈顯著性下調表達，而后漸恢復正常水平；IAA與ABA聯合處理草莓時，FvIAA17基因表達模式與IAA單獨處理時表達趨勢有相似性，但強度明顯下降，表明2種激素同時存在，對草莓FvIAA17基因的調控作用IAA處于主導地位，表明在草莓發育過程中，生長素和ABA對FvIAA17基因有一定的聯合調控作用，推測FvIAA17基因可能在響應生長素和脫落酸互作調控草莓發育過程中發揮一定的作用。

Aux/IAA家族基因在生長素信號轉導過程的重要成員之一，本研究結果可初步推測FvIAA17基因可能在草莓發育有一定的功能作用，并且可能參與生長素與脫落酸互作調控草莓果實發育過程，但對于FvIAA17基因對草莓的生物學功能和作用機制需通過遺傳轉化手段進行進一步的驗證，進而在分子水平上揭示FvIAA17基因調控草莓果實發育的機制，為將來草莓優良品種的培育提供理論基礎。