谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)對逆境脅迫的響應

趙晉鋒，王高鴻，杜艷偉，李顏方，王振華，趙根有，余愛麗

(山西省農業科學院 谷子研究所，特色雜糧種質資源發掘與育種山西省重點實驗室，山西 長治 046011)

谷子(Setariaitalica(L.)P. Beauv.)是起源于我國的C4禾本科作物，不僅具有蒸騰系數低、凈光合強度和水分利用效率高、抗逆性強、適應性廣等特點，而且谷子基因組小，高度保守，DNA重復度低，非常便于研究[13]。同時谷子在其生長周期中會經常遇到眾多非生物逆境脅迫，比如干旱、鹽漬、低溫、高溫、洪澇以及病蟲害侵染等,這些逆境嚴重影響了作物的生長發育和產量品質[14-16]。目前為止，盡管PEPC基因相關研究開展頗多，但是谷子中PEPC基因在非生物逆境下的表達研究報道很少。

本研究發掘了谷子中的SiPEPC(Seita.1G020700)基因，并對其氨基酸序列、蛋白特征、功能、信號途徑、順勢應答元件等參數特征進行分析和預測，隨后分析了該基因在幼苗期逆境脅迫下的動態表達模式以及在拔節、抽穗、灌漿3個生育時期不同光照處理和干旱脅迫下的表達，旨在為進一步分析SiPEPC基因在谷子逆境應答信號途徑中的功能和機制以及為利用基因工程方法改善作物光合速率和提高產量提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試谷子品種為豫谷1號。

試驗所用 LATaqDNA聚合酶，逆轉錄酶和RNA酶抑制劑均購自寶生物工程有限公司；引物及其他常規生化試劑購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 在幼苗生長至三葉期時，分別對其進行 20% PEG，鹽(250 mmol/L NaCl)，ABA(100 μmol/L)和低溫(4 ℃) 脅迫處理，于0，1，3，6，12，24 h整株取樣[17]。另外，在旱棚種植豫谷 1 號，光照處理為當植株出苗后用黑色遮陽網分別遮擋1層(光照Ⅰ處理)，2層(光照Ⅱ處理)至成熟收獲；對照生育期內正常澆水；干旱處理只澆3次關鍵水，分別為拔節、抽穗、灌漿期取樣后澆水，其他時間采用自然控水方式控水；其他農田管理措施相同。所有樣品葉片取樣后立即在-80 ℃冰箱中速凍備用。試驗設2次生物學重復。

1.2.2 引物設計和植物總RNA提取 植物總RNA提取參照生工TRIzol試劑盒說明書，試驗中涉及的其他試劑配制參照《分子克隆》第3版[18]。引物設計用 Primer Primer 5.0軟件根據SiPEPC、SiGAPB轉錄序列設計SiPEPC及對照SiGAPB熒光實時定量PCR引物。

1.2.3SiPEPC基因發掘和生物信息學分析 利用擬南芥中已鑒定PEPC基因序列在JGI 谷子數據庫(Ver.2.1)進行比對發現siPEPC基因(Seita.1G020700)。SiPEPC蛋白理化特性、氨基酸組成、一二級結構等用ExPASy網站ProtParam pI/Mw在線工具預測；SiPEPC潛在功能用Profun 2.2 Server預測，信號肽用SignalP 4.1 Server 進行分析；SiPEPC編碼蛋白亞細胞定位用Psort在線工具預測；SiPEPC氨基酸同源性序列用Blast工具在NCBI上查找。同源基因序列用ClustalX 1.83軟件比對分析，不同物種PEPC基因(玉米ZmPEPC、高粱SbPEPC、谷子SiPEPC、水稻OsPEPC、擬南芥AtPEPC、大豆GmPEPC、北美云杉PsPEPC、小立碗蘚PpPEPC，其GenBank序列號分別為NP_001105503.1、XP_002451855.1、RCV04685.1、AAG00180.1、AAC24594.1、NP_001241357.1、ABR17346.1和XP_024395991.1)進化樹用Mega 4.1軟件構建并比較分析[19]。

1.2.4 光照強度測定 在不同生育期用光強測定儀(GM1040)于晴天上午 9：00-10：00測量光照強度，測量10次數值，取平均值。具體生育期測量光照強度值如表1所示。

1.2.5 Real-time PCR 分析 總RNA樣品反轉錄合成cDNA，均一化后作為實時定量PCR 模板，以SiGAPB作為內參基因。經預試驗優化后，PCR反應程序為：95 ℃ 預變性2 min；95 ℃變性7 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸 15 s，共 45 個循環。SiPEPC在逆境脅迫下轉錄水平變化采用相對定量 2-ΔΔCt方法計算，設3次重復[20]。

表1 不同處理各生育期光照強度值Tab.1 Light intensity values of treatments at different growth stages ×104 lx

2 結果與分析

2.1 SiPEPC基因序列的獲得與參數分析

通過 NCBI 數據庫比對從谷子數據庫中得到谷子 PEPC(Seita.1G020700)基因，蛋白結構域在線分析顯示，該基因存在 PEPcase(PF00311)結構域(164-965 Aa)，因此，確認該基因為PEPC家族成員(圖1)。該基因組序列長6 652 bp，轉錄序列3 366 bp，CDS 序列2 898 bp，編碼965個氨基酸，無內含子和可變剪切。同源序列分析顯示，不同物種PEPC基因非常保守，相似性較高，所有PEPC蛋白一致性(Identity)為89.09%。

圖中黑色背景氨基酸表示相同氨基酸殘基，灰色背景氨基酸表示相似氨基酸殘基(≥60% similarity)；序列中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶結構域用黑色連字符方框標出。The black background amino acids represent the same amino acid residues, and the gray background amino acids represent similar amino acid residues(≥60% similarity)；The phosphoenolpyruvate carboxylase domain in the sequence is indicated by a black hyphen box.

2.2 SiPEPC 基因的生物信息學分析

2.2.1 SiPEPC蛋白參數分析SiPEPC(Seita.1G020700)基因蛋白分子式為 C4906H7796N1360O1449S37，分子質量為 110.20 ku，等電點(pI)為5.77，平均疏水性(GRAVY)-0.351，脂肪系數(AI)92.41，不穩定指數44.74。二級結構預測顯示，螺旋(包括 α-，pi-and 3_10-helix)58.65%，β-折疊鏈 3.11%，loop 環為 38.24%。溶劑可及性分析顯示，膜外 40.41%，膜內 48.91%，鑲嵌 10.67%。亞細胞位置預測結果推測，SiPEPC(Seita. 1G020700)基因所編碼的蛋白被定位在細胞質中(預測置信度97%)。另外， Psort 軟件預測該基因可能存在線粒體基質、微體(過氧物酶體)、細胞核、葉綠體類囊體膜，其預測概率大小依次為 51.6%，30.0%，30.0%，28.0%。根據SignalP 4.1 Server軟件預測可知，SiPEPC第36位丙氨酸殘基具有最高的原始剪切位點，分值為 0.107；第11位谷氨酰胺信號肽分值最高，為 0.130；最高的綜合剪切位點位于第1位甲硫氨酸殘基，其值為 0.197。綜合來看，SiPEPC氨基酸殘基的加權平均值較小，為0.138(小于 0.500)，推測SiPEPC基因編碼的蛋白為非分泌蛋白。

2.2.2 谷子SiPEPC基因啟動子區域順式元件分析和功能預測 順式元件分析發現，在SiPEPC(Seita. 1G020700)基因啟動子區域主要包括光應答元件(3-AF1 binding site、ATCT-motif、Box 4、G-Box、GATA-motif、LAMP-element、TCT-motif)，激素類應答元件 ABRE(Abscisic acid responsiveness)，P-box(Gibberellin-responsive element)，TCA-element (Salicylic acid responsiveness)，逆境類應答元件 TC-rich repeats(Defense and stress responsiveness)以及其他類元件，包括厭氧誘導 ARE(Anaerobic induction)，缺氧特異誘導的增強子 GC-motif(Enhancer-like element involved in anoxic specific inducibility)，生長素 TGA-element(Auxin-responsive element)。Profun 2.2 Server 軟件預測顯示，SiPEPC 蛋白具有 C-C裂解酶活性、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性、鎂離子結合等活性，可能參與單體代謝、有機物代謝、固碳、三羧酸循環、需氧呼吸、前體代謝物和能量的產生、細胞呼吸、氧化還原以及初級代謝等生物過程。

2.2.3 PEPC氨基酸序列進化樹分析 用Neighbor-joining方法構建谷子、擬南芥、玉米、高粱、水稻、北美云杉、小立碗蘚等物種中的PEPC氨基酸序列進化樹。序列比對結果顯示SiPEPC與高粱、玉米和水稻中PEPC基因同源性非常高，序列一致性分別為96.21%，96.11%和93.65%；而SiPEPC與擬南芥、大豆、北美云杉、小立碗蘚的序列一致性則相對略低，分別為82.79%，81.86%，82.99% 和74.59%。進化樹結果也顯示，SiPEPC與高粱、玉米和水稻中PEPC基因親緣關系較近，而與擬南芥、大豆、北美云杉、小立碗蘚的親緣關系較遠(圖2)。

每個位點氨基酸替代值在底部用0.01刻度值標出。Amino acid substitution values of each site were labeled with a 0.01 scale value at the bottom.

2.3 不同非生物逆境脅迫下SiPEPC 基因表達分析

如圖3所示，苗期4種脅迫處理下SiPEPC基因表達量變化模式不完全相同，但在受到脅迫后均被誘導，其表達量均有所上調。在ABA處理時，表達量呈現下調上調交替出現，在 12 h 被誘導達到最高，為對照的8.20倍；在低溫誘導時，表達量持續上升，在24 h達到最高，為對照的9.70倍；在PEG和NaCl處理時，表達量整體呈上升趨勢，均在12 h達到最高，分別為相應對照表達量的4.85,9.96倍，在24 h 其表達量均急劇下調。

2.4 不同生育期 SiPEPC 基因在干旱和光照處理下的表達分析

如圖 4 所示，拔節期干旱條件下(光照5.85萬lx)SiPEPC基因表達被誘導；干旱+光照 Ⅰ(1.32萬lx)處理下表達量下調；干旱+光照Ⅱ(0.31萬lx)處理條件下該基因表達量上調至對照的 2.74 倍。抽穗期干旱條件下(光照9.35萬lx)SiPEPC基因表達被誘導上調；干旱+光照Ⅰ(2.45萬lx)以及干旱+光照Ⅱ(0.57萬lx)處理條件下該基因表達量均下調。灌漿期干旱條件(光照7.65萬lx)，干旱+光照Ⅰ(0.98萬lx)以及干旱+光照Ⅱ(0.35萬lx)處理條件下該基因表達量均下調。

圖3 SiPEPC(Seita. 1G020700)在不同逆境處理下的 Real-time PCR 表達分析Fig.3 Real-time PCR expression analysis of SiPEPC(Seita. 1G020700)under different stress treatments

A.不同生育期光照強度值；B.拔節期不同處理SiPEPC基因表達；C.抽穗期不同處理 SiPEPC 基因表達；D.灌漿期不同處理 SiPEPC 基因表達。A.The light intensity of different growth stage;B.The expression of SiPEPC under different treatments at jointing stage;C. The expression of SiPEPC under different treatments at heading stage;D.The expression of SiPEPC under different treatments at filling stage.

3 結論與討論

3.1 SiPEPC 基因編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白

本研究通過生物信息學方法得到抗旱耐瘠作物谷子的SiPEPC基因 (Seita.1G020700), 該基因序列長6 652 bp，轉錄序列 3 366 bp，CDS 序列 2 898 bp，編碼965個氨基酸，無內含子和可變剪切，功能域分析揭示，164-965位氨基酸為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶結構域 (PEPcase Motif)，因此，推測該基因為谷子 PEPC 家族成員。不同物種中PEPC蛋白序列比對發現，PEPC 蛋白非常相似，所有比對PEPC序列整體一致性為89.09%，具有非常保守的序列結構。另外，SiPEPC與高粱、玉米和水稻中PEPC基因同源性非常高,其序列一致性分別為96.21%，96.11%，93.65%；而與擬南芥、大豆、北美云杉、小立碗蘚的序列一致性則相對較低，分別為82.79%，81.86%，82.99%，74.59%。此結果和這些物種在植物分類上的親緣關系是一致的(高粱、玉米、谷子是禾本科 C4 作物，水稻是禾本科單子葉作物，擬南芥屬十字花科雙子葉作物，大豆屬于豆科雙子葉作物，而北美云杉和小立碗蘚分別屬于裸子植物和苔蘚植物的典型代表)。另外，SiPEPC和玉米、高粱水稻同源基因在系統發育進化樹中也聚在一起，也證明了這一推論。此外，在北美云杉 (裸子植物) 和小立碗蘚(苔癬類植物)中存在 PEPC 同源基因，說明了PEPC基因的祖先在裸子植物和被子植物分離之前就已存在。

3.2 SiPEPC基因參與多種逆境應答

研究表明，PEPC轉基因株系的抗旱、耐鹽等抗逆性能得到了明顯提高，而且在逆境脅迫下維持了較高的光合速率[21-25]。順式元件分析也發現，在SiPEPC(Seita. 1G020700)基因啟動子區域逆境類應答元件和激素類元件。所以，比較關注該基因在逆境下對逆境脅迫的響應。因此，本研究分別用20% PEG、ABA(100 μmol/L)、低溫(4 ℃)、鹽(250 mmol/L NaCl)等逆境處理豫谷1號幼苗，然后用 Real-time PCR 分析其在不同處理下的表達情況，結果表明，SiPEPC基因在 4 種脅迫處理下其表達量均有顯著上調，在 ABA、低溫、PEG和NaCl脅迫時，其誘導表達量最高值分別為對照的8.20，9.70，4.85，9.96倍，說明SiPEPC基因在谷子苗期對逆境響應明顯，可能在逆境應答信號途徑中調整植物的光合作用來響應不同逆境脅迫。為了解該基因在不同生育期逆境脅迫和不同光照強度下的表達情況，本研究在旱棚種植材料設計試驗用Real-time PCR進行了分析，結果表明，在拔節期和抽穗期干旱正常光照下，SiPEPC基因表達量均被誘導上調(分別為對照2.20倍和2.10倍)，但是在灌漿期其表達量是下調的(對照的0.28倍)，說明SiPEPC基因在干旱正常光照下的拔節期和抽穗期對干旱的響應比灌漿期強烈；而在干旱光照Ⅰ(中等光照)和光照Ⅱ(弱光照)的抽穗期和灌漿期SiPEPC基因表達被下調；但是在干旱和光照Ⅱ條件下的拔節期中SiPEPC表達量被上調，達對照的2.74倍。說明該基因在干旱條件下中等和弱光照條件下的抽穗期和灌漿期可能起作用較小。這些試驗結論進一步驗證了順勢元件分析結果，證明了SiPEPC基因在植物逆境應答中起一定作用，尤其是在苗期受到不同逆境的強烈誘導。

進一步研究表明，SiPEPC基因在拔節期和抽穗期正常光照下參與了對干旱脅迫的響應，而干旱條件下的中等光照和弱光照處理下SiPEPC基因表達在不同生育期幾乎都受到嚴重抑制，有可能是弱光處理嚴重影響了干旱條件下的基因表達。功能預測分析顯示，SiPEPC可能參與單體代謝、有機物代謝、固碳、三羧酸循環、需氧呼吸、前體代謝物和能量的產生、細胞呼吸、氧化還原以及初級代謝等生物過程，其中大部分功能與光合作用有關的。逆境脅迫下SiPEPC基因是如何參與調控這些生物過程仍有待進一步詳細驗證。

植物生長發育過程中經常面臨各種非生物逆境脅迫的挑戰，如干旱、高鹽、低溫等，這些逆境脅迫對植物的生長發育影響最為明顯，是制約農作物產量和品質的主要限制因素[26]。本研究對預測谷子SiPEPC基因的氨基酸序列、蛋白特征、功能、信號途徑、順勢應答元件等參數特征進行系統的預測和分析，并對該基因在苗期不同逆境處理及不同生育期干旱脅迫下的動態表達情況進行了初步分析，結果表明，SiPEPC因表達量在谷子幼苗期被ABA、低溫、PEG、高鹽脅迫誘導均上調；SiPEPC基因在谷子拔節期和抽穗期正常光照強度下參與了對干旱脅迫的響應。因此，推測SiPEPC(Seita.1G020700)基因參與了谷子對非生物逆境的應答，可能在干旱和其他逆境脅迫信號途徑中起關鍵作用。研究結果將為今后開展SiPEPC基因功能和利用研究提供試驗數據支持。