稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中TNF-α、NF-κB以及caspase-3的表達(dá)及其相關(guān)性

畢穎 董明慧 劉曉麗 陳湘玲 王維香

胚胎或是胎兒已經(jīng)死亡且滯留在宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出的情況在臨床上稱(chēng)之為稽留流產(chǎn)(missed abortion，MA)，近些年相關(guān)研究報(bào)道稱(chēng)，MA的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)；也因此引得臨床上的重視[1]。在MA發(fā)病因素的相關(guān)分析[2]中發(fā)現(xiàn)，感染與MA的發(fā)生有重要關(guān)系。報(bào)道[3]稱(chēng)，病原菌感染引起的子宮內(nèi)膜炎癥會(huì)使得巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞釋放一系列的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)、白細(xì)胞介素1-β等，從而刺激k基因結(jié)合核因(nuclear factor-k-gene binding，NF-κB信號(hào)通路激活，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和促進(jìn)局部免疫功能失衡。腫瘤壞死因子的升高還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)是細(xì)胞凋亡中最重要的終末剪切酶，兩者可能存在一定的相關(guān)性。因此，本研究對(duì)比稽留流產(chǎn)患者與對(duì)照組流產(chǎn)后絨毛組織中TNF -α、NF-κB以及caspase-3的表達(dá)變化，并分析三者之間的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

1.研究對(duì)象：將2016年1月—2017年1月本院收治的30例早期稽留流產(chǎn)患者納入研究，為稽留流產(chǎn)組；選擇同期在本院自愿要求終止妊娠的正常妊娠早期婦女30例為對(duì)照組。患者年齡為27～31歲，平均年齡為(27.9±2.2)歲，平均停經(jīng)時(shí)間為(62.4±6.1)d；二組患者的一般臨床資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具可比性。

2.病例納入排除標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》(第7版)的稽留流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診稽留流產(chǎn)者；所有研究對(duì)象既往月經(jīng)規(guī)律，均無(wú)宮內(nèi)節(jié)育器、生殖道發(fā)育異常、明顯感染及重要臟器疾病史，近3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)任何激素類(lèi)藥物、無(wú)外傷及毒物放射線接觸史、無(wú)遺傳史。對(duì)照組無(wú)流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)等不良孕產(chǎn)史；所有入選研究對(duì)象對(duì)本研究知情同意。

3.方法：收集以上研究對(duì)象的絨毛組織，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)定其中TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定TNF-α、NF-κB、caspase-3蛋白的表達(dá)情況，具體步驟如下。

(1) 主要試劑：Trizol試劑和兩步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司，TNF-α、NF-κB以及Caspase-3 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司合成。

(2) 標(biāo)本的采集及保存：負(fù)壓吸引術(shù)吸出孕囊后，立即分離出絨毛組織，無(wú)菌生理鹽水沖洗干凈，即刻分裝于經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理過(guò)的2 ml凍存管中，15 min內(nèi)置于80℃低溫冰箱中保存。l份用于RT-PCR，另1份用于EL1SA檢測(cè)。

(3)RT-PCR反應(yīng)：用Trizol試劑提取絨毛組織的總RNA。每個(gè)標(biāo)本分別提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，cDNA的合成嚴(yán)格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。NF-KB上游引物為5′-CCTGGATGACTCTTGGGAAA-3′，下游引物為5′-TCAGCCAGCTGTTTCATGTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度358bp；TNF-α上游引物為5′-TCAGAGGGCCTGTACCCTCAT-3′，下游引物為5′-GGAAGACCCCTCCCAGATAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度313 bp；caspase-3上游引物為5′-GTCGAGTCCAGTCCAAGTCCAT-3′，下游引物為5′-ACGTGGTCAACCGTCGACCTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為205 bp；內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度104 bp。反應(yīng)體系為50 ul，其中5 U/td DNA聚合酶1 ul、上游引物1 ul、下游引物1 ul、2.5 mmol/L三磷酸脫氧核苷(dNTP)4 ul、cDNA 2 ul、10×緩沖液5 ul、DEPC 36 ul。反應(yīng)條件：TLR-4和NF-κB：94℃ 5 min (94℃ 30 s+56℃ 35 s+72℃ 2 min)×35+(72 ℃ 10 min：HBD-2：94℃5 min}(94℃ 30 s}(59℃ 35s}72℃ 2 min)×35+72℃ 10 min；β-actin：94℃ 5 min (94℃ 30 S+62℃ 35s72℃ 2 min)×35+72℃ 10min。取3 L PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳情況進(jìn)行分析，并取攝圖像供Quantity One圖像分析軟件分析其灰度值。實(shí)驗(yàn)中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平=目的基因條帶的灰度值/β-actin條帶灰度值。

(4)ELISA試驗(yàn)：采用ELISA(固相夾心法)測(cè)定絨毛組織中TNF-α、NF-κB、caspase蛋白的表達(dá)水平。絨毛組織中加入無(wú)菌生理鹽水(1 g絨毛組織加9 ml無(wú)菌生理鹽水)進(jìn)行勻漿后，依次按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

結(jié)果

1.兩組TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA表達(dá)情況比較：在稽留流產(chǎn)患者的絨毛組織中TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA的表達(dá)水平分別為(3.2±0.3)(2.5±0.3)(0.2±0.0)，均顯著高于正常對(duì)照組(1.0±0.3、1.0±0.2、0.1±0.0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；見(jiàn)表1。

表1 2組TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA表達(dá)情況比較

注：兩組比較，*P<0.05

2.兩組TNF-α、NF-κB、caspase蛋白的相對(duì)表達(dá)情況比較：稽留流產(chǎn)組與對(duì)照組各蛋白含量比值進(jìn)行比較(表2)，稽留流產(chǎn)患者的絨毛組織中TNF-α、NF-κB、caspase-3 蛋白水分別為(0.5±0.0)(0.4±0.0)(0.9±0.2)，均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表2 2組TNF-α、NF-κB、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)情況比較

注：兩組比較，*P<0.05

3.TNF-α、NF-κB、caspase-3表達(dá)的相關(guān)性Person分析：Person分析結(jié)果顯示,TNF-α與NF-κB的表達(dá)成正相關(guān)(r=0.415，P<0.05);TNF-α與caspase-3表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.628，P<0.05)。

討論

MA是一種特殊的自然流產(chǎn)類(lèi)型，也屬于病理性流產(chǎn)，指的是胚胎或是胎兒已經(jīng)死亡且滯留在宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出的情況[4]。對(duì)MA的病因研究[5]發(fā)現(xiàn)，胚胎因素、免疫系統(tǒng)因素、感染等生理因素以及環(huán)境、社會(huì)等外界因素均會(huì)引起稽留流產(chǎn)的發(fā)生；其中，感染因素在近年來(lái)越來(lái)越受到臨床上的重視。有研究認(rèn)為，病原菌感染引起的子宮內(nèi)膜炎癥會(huì)使得巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞釋放一系列的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素1-β等，從而刺激NF-κB信號(hào)通路激活，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和促進(jìn)局部免疫功能失衡[6]；且當(dāng)TNF-α水平過(guò)高時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞表面絨毛組織的減少，導(dǎo)致組織水腫、細(xì)胞受損[7]。TNF-α是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并在生物組織中廣泛表達(dá)，是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。研究[8-9]證實(shí)，一定水平的TNF-α可對(duì)妊娠期機(jī)體產(chǎn)生有利的促胚胎發(fā)育作用，同時(shí)可以改善孕體能量代謝、維持妊娠，主要因?yàn)門(mén)NF-α可促進(jìn)機(jī)體內(nèi)合成更多的孕激素及絨毛組織促性腺激素，其在刺激細(xì)胞滋養(yǎng)層生成尿激酶型纖溶酶原激活劑的同時(shí)，有利子宮蛻膜組織外基質(zhì)降解及胎盤(pán)植入。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，主要參與調(diào)控機(jī)體免疫、炎癥、細(xì)胞增殖分化及凋亡等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，尤其是免疫與炎癥反應(yīng)。研究[10]認(rèn)為，MA患者絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡增加是引起MA的重要病理過(guò)程。Caspase-3是細(xì)胞凋亡中最主要的一種剪切酶，經(jīng)激活后的Caspase-3可裂解大量的底物，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[11]。因此，在本研究中通過(guò)蛋白定量技術(shù)、ELISA等測(cè)定TNF-α、NF-κB、caspase mRNA及蛋白的表達(dá)，判斷在稽留流產(chǎn)患者人群中TNF-α、NF-κB、caspase-3變化的意義；并通過(guò)Person分析確定TNF-α、NF-κB、caspase-3在稽留流產(chǎn)表達(dá)中的相關(guān)性。

在本研究中，RT-PCR結(jié)果顯示，在稽留流產(chǎn)患者的絨毛組織中TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA的表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組。ELISA測(cè)定結(jié)果顯示，稽留流產(chǎn)患者的絨毛組織中TNF-α、NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組。這提示了炎癥因子在稽留流產(chǎn)的病理過(guò)程中有重要作用，且與炎癥通路和細(xì)胞凋亡相關(guān)。此外，Person分析結(jié)果顯示，TNF-α與NF-κB的表達(dá)成正相關(guān)，與caspase-3的表達(dá)亦呈正相關(guān)。出現(xiàn)這一結(jié)果的可能原因如下：(1)當(dāng)母體免疫功能異常或炎癥反應(yīng)誘使巨噬細(xì)胞釋放TNF-α增多，使得TNF-α水平表達(dá)增加；(2)上升的TNF-α水平激活NF-κB信號(hào)通路，使NF-κB表達(dá)上調(diào)；而NF-κB會(huì)進(jìn)一步的加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致TNF-α的釋放增加；(3)TNF-α水平過(guò)高時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡；研究認(rèn)為，caspase-3的表達(dá)與滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，當(dāng)caspase激活時(shí)會(huì)促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)流產(chǎn)的發(fā)生[12-13]。因此，本研究提示，TNF-α水平和caspase-3的表達(dá)過(guò)高導(dǎo)致的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)流產(chǎn)的發(fā)生；進(jìn)一步分析則顯示，體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生促使TNF-α的高表達(dá)，即體內(nèi)炎癥導(dǎo)致的TNF-α的高表達(dá)與caspase激活(表達(dá)增加)共同促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致流產(chǎn)。

綜上所述，在稽留流產(chǎn)患者的絨毛組織中TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA及蛋白的表達(dá)含量均會(huì)增高，這提示稽留流產(chǎn)的發(fā)生與患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)及滋養(yǎng)層細(xì)胞過(guò)度凋亡可能存在相關(guān)關(guān)系；但是三者之間的具體作用機(jī)制，仍待進(jìn)一步的研究。