叉頭框轉錄因子3a和β-連環蛋白在胚胎停育絨毛組織中的表達及意義

馮靜 趙莉萍

胚胎停育是指因受精卵缺陷或母體存在不利妊娠的因素，如遺傳因素、免疫因素、感染、母體內分泌失調、細胞增殖和凋亡、血栓因素、解剖異常、環境因素等，導致早期或中期胚胎死亡，全部或部分的組織留在宮腔內未能自然排出的一種病理性妊娠，病因十分復雜，有約40%～50%的胚胎停育原因未明[1]。胚胎停育是一種特殊類型的自然流產，近年來，發病率有明顯升高趨勢，這對孕婦的身心健康造成嚴重影響，因此，探究胚胎停育的病因，為早期預防以及改善妊娠結局提供新的理論依據顯得尤為重要。叉頭框蛋白O家族的核心是叉頭框轉錄因子3a(forkhead box O transcription factors 3a,FoxO3a)，目前研究發現其在細胞、組織與胚胎發育、卵泡成熟、血管生成、免疫反應及細胞凋亡等過程中發揮重要作用[2-3]。β-連環蛋白(β-catenin)是一種多功能胞內蛋白，既是Wnt/β-catenin通路中的信號傳導分子，又是細胞間重要黏附分子，這兩種功能可相互獨立發揮作用。一方面，可作為轉錄輔助激活因子，參與轉錄的激活；另一方面，可參與錨定細胞骨架與E-鈣黏蛋白(E-cadherins)，涉及細胞-細胞黏附接頭的組成，在子宮內膜蛻膜化期間的細胞黏附中起重要作用[4]。本文旨在使用免疫組織化學技術SP法檢測胚胎停育患者絨毛中FoxO3a和β-catenin的表達情況，初步探討二者的作用及其與絨毛滋養細胞過度凋亡的關系。

對象與方法

一、研究對象

選取2017年10月—2018年6月就診于包鋼集團第三職工醫院婦產科門診，經彩超證實為胚胎停育者30例，停經7～11周，年齡24～37歲，平均年齡(29.6±2.5)歲。隨機選取同期正常妊娠，經彩超證實為宮內早孕有胎心搏動，自愿要求負壓吸引術流產者30例，停經6～9周，年齡20～40歲，平均年齡(27.1±4.1)歲。兩組研究對象既往月經周期規律，在取標本前3個月內均未服用激素類藥物，未放置宮內節育器，無生殖道感染，無內外科合并癥，術前簽署知情同意書。比較兩組年齡、孕周及體重指數，差異均無統計學意義(P>0.05),男方年齡差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組患者一般情況比較Table 1 Comparison of basic information between two groups

*Compared with normal early pregnant group,P<0.05

二、方法

1.標本采集與免疫組織化學技術SP法處理：負壓400 mmHg吸引出入選研究組、對照組的絨毛組織及蛻膜等宮腔內容物后，絨毛組織置于生理鹽水中漂洗，洗凈表面血跡后取標本約0.5×0.5×0.5 cm3置于體積分數為10%中性甲醛固定液中固定并石蠟包埋，每個組織標本蠟塊按厚度4 μm連續切片2張，分別采用鏈菌素親生物蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidn peroxides conjugated method，S-P法)檢測FoxO3a和β-catenin的表達。常規脫蠟水化、抗原熱修復后，嚴格按試劑盒(KIT-9710，購自福州邁新公司)說明書進行實驗步驟。兔抗人FoxO3a多克隆抗體(ab70314)購于美國ABCAM公司，鼠抗人β-catenin單克隆抗體(610154)購自美國BD生物技術公司，二者稀釋濃度均為1:200。自然晾干后閱片，陽性對照為試劑公司所提供的陽性片，PBS代替一抗作為陰性對照。

2.結果判定：由2位病理醫師采用雙盲法在光鏡下進行觀察和評定。每張切片隨機選取 5個視野，每個視野計數100個細胞。FoxO3a及β-catenin均主要表達于滋養細胞的細胞質和細胞核，β-catenin在正常妊娠組部分表達于細胞膜，二者陽性信號均為出現淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。根據顯色強度和陽性細胞百分率進行半定量判定。(1)按照顯色強度分為無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別評為0、1、2、3分。(2)按照陽性細胞百分率計為<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，>50%計3分。最后根據兩者乘積，(1)×(2)，將染色情況分為4級：0～1分為(-)，2～3分為(+)，4～6分為(++)，>6分為(+++)。乘積<2分判定為陰性(-)，≥2分判定為陽性(+)。

結 果

一、兩組滋養細胞中FoxO3a的表達情況

FoxO3a主要表達于胚胎停育組滋養細胞的細胞質和(或)細胞核，正常妊娠組滋養細胞的細胞質(圖1)。FoxO3a在胚胎停育組、正常妊娠組絨毛滋養細胞中陽性表達率分別為36.7%(11/30)和63.3%(19/30)，FoxO3a在胚胎停育組陽性表達率低于正常妊娠組，差異有統計學意義，見表2。

二、兩組滋養細胞中β-catenin的表達情況

β-catenin主要表達于胚胎停育組滋養細胞的細胞質和(或)細胞核，正常妊娠組滋養細胞的細胞膜和(或)細胞質(圖2)。β-catenin在胚胎停育組、正常妊娠組絨毛滋養細胞中陽性表達率分別為56.7%(17/30)和26.7%(8/30)，β-catenin在胚胎停育組陽性表達率高于正常妊娠組，差異有統計學意義，見表2。

三、兩組滋養細胞中FoxO3a與β-catenin表達的相關性

FoxO3a與β-catenin在胚胎停育組中的表達呈負相關性(rs=-0.591，P<0.05)，二者在正常妊娠組中的表達無相關性(rs=-0.099，P>0.05)，見表3。

圖1 FoxO3a表達的病理圖(免疫組化SP染色,×100)Figure 1 The pathology of figure of FoxO3a′s expression (immunohistochemical SP staining, ×100)

GroupnFoxO3a+-β-catenin+-missed abortion group3011(36.7)?19(63.3)17(56.7)?13(43.3)normal earlypregnant group3021(70.0)9(30.0)8(26.7)22(73.3)total6032(53.3)28(46.7)25(41.7)35(58.3)

*Compared with normal early pregnant group,P<0.05

圖2 β-catenin表達的病理圖(免疫組化SP染色,×100)Figure 2 The pathology of figure of β-catenin′s expression (immunohistochemical SP staining, ×100)

FoxO3aβ-cateninmissed abortion group-+totalβ-cateninearly pregnant group-+total-41519639+921116521total13173022830

討 論

一定程度的滋養細胞凋亡在正常妊娠生理活動中是存在的[5]，主要發生在合體滋養層細胞，在胚胎生長發育過程中，增殖-凋亡的狀態平衡利于形成絨毛內血管及分支并保持相關的侵襲能力[6]。當某因素導致增殖-凋亡的平衡狀態被打破后，絨毛胎盤血管增殖不良，滋養細胞侵襲力降低，絨毛凋亡增加，生長發育受阻，最終導致胚胎停育，這可能是早期自然流產發生的一個重要病理過程。近期研究表明，自然流產妊娠組織中存在著過度凋亡，而且過度凋亡的發生與促凋亡基因的高表達有關[1]。有學者研究顯示，FoxO3a可誘導促凋亡因子表達，進而激活半胱氨酸蛋白酶(Caspases)，使卵母細胞、淋巴細胞、神經元以及腫瘤細胞等多種細胞發生凋亡[7-9]。而FoxO3a在合體滋養細胞胞質的高表達可有利于維持妊娠[10]。FoxO3a在細胞核和細胞質等亞細胞結構中的定位受磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt) 信號通路影響，對凋亡的調節產生重要作用[11-13]。KIM等[11]推測正常早期妊娠滋養細胞中FoxO3a磷酸化后被轉運至胞質處在失活狀態，阻礙凋亡基因表達可使合體滋養細胞維持正常生理狀態；而稽留流產滋養細胞FoxO3a在胞質中表達下降，并出現較多胞核內表達，去磷酸化的 FoxO3a大部分進入胞核，使凋亡基因表達最終加速細胞凋亡，從而導致絨毛正常發育的平衡狀態失衡引起胚胎停育。本實驗與其研究結果一致，本實驗中FoxO3a在胚胎停育組絨毛滋養細胞中陽性表達率低于正常妊娠組，差異有統計學意義。

胚胎發育過程中Wnt/β-catenin信號通路參與調控胚胎干細胞分化、凋亡和定位等生物學過程。胚胎附著子宮內膜的過程是著床，成功著床的標志是胎盤血管形成及母體蛻膜滋養細胞侵襲。Wnt/β-catenin信號通路調控胚胎著床包括2個方面：激活胚胎植入位點上皮細胞調節靶基因的表達，使胚胎著床后的血管重塑胎盤形成；在胚胎植入前激活子宮環形平滑肌，調節胚胎對子宮內膜的黏附和侵入。胚胎著床窗子宮內膜β-catenin蛋白表達暫時性下調或缺失,有利于促進子宮內膜上皮細胞的分離和胚胎著床[14]。本實驗發現，β-catenin在胚胎停育組絨毛滋養細胞中陽性表達率高于正常妊娠組，差異有統計學意義。這提示β-catenin在胚胎停育過程中扮演著重要角色。

本實驗得出胚胎停育組絨毛滋養細胞中FoxO3a與β-catenin表達呈負相關，提示二者可能共同參與了細胞過度凋亡和胚胎停育的過程。二者在諸多細胞生命活動中有重要意義，其相互之間作用可影響各自表達和功能，從而調控細胞凋亡。如FoxO3a能可逆性同T細胞因子(TCF)/淋巴增強因子(LEF)競爭結合β-catenin，阻斷Wnt信號通路下游靶基因的激活。FoxO3a靶基因GABARAPL1可通過促進自噬降解Dvl2蛋白抑制Wnt/β-catenin信號通路[15]。有學者在一項實驗中證實當實驗組加入抑制劑后，β-catenin的表達被抑制，而FoxO3a的表達較對照組升高，提示FoxO3a受Wnt/β-catenin負調控，可能是其下游分子[16]。綜上所述，FoxO3a與β-catenin在胚胎停育過程中發揮重要作用，更深入研究二者在發生胚胎停育信號通路中的具體機制，明確胚胎停育細胞過度凋亡的發病機理，將為早期預防及改善妊娠結局提供新的理論依據。