褪黑素通過抑制JAK2/STAT3通路抑制IL-6誘導的卵巢癌SKOV3細胞上皮間質轉化

謝婷婷 李雯惠 蘇瑛 韓碧潔 于月成

卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤[1]。雖然近年來卵巢癌的手術治療和放化療手段有了很大的進步，但是由于該疾病的早期病變不明顯，且病情進展迅速，多數患者在確診時已經處于晚期，這導致了該疾病的5年生存率低于30%，且預后較差[2-3]。癌細胞轉移可促進卵巢癌的疾病進展，降低患者的生存率[3]。上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是促進癌細胞轉移的一個重要分子機制[4]。白細胞介素(interleukin，IL)-6是癌相關成纖維細胞和癌細胞產生的一個促炎因子，其在卵巢癌患者的血清和腹水中表達上調，其表達不僅與患者的不良預后相關，也與卵巢癌細胞的浸潤和轉移特征有關[5]。IL-6可以促進卵巢癌細胞的EMT[6]。褪黑素主要是由松果體分泌的吲哚類物質。Zhao等[7]研究發現褪黑素在卵巢癌患者血清中的水平低于正常女性。褪黑素不僅能夠抑制卵巢癌細胞的活力[8]，還可以抑制卵巢癌干細胞的遷移和侵襲、減少其EMT進程[9]。但是褪黑素對IL-6誘導的卵巢癌細胞EMT還沒有相關研究。因此，本研究用重組IL-6蛋白和褪黑素共同處理卵巢癌SKOV3細胞，探究褪黑素對IL-6誘導的細胞增殖、遷移和EMT的作用和機制。

材料與方法

一、材料

卵巢癌SKOV3細胞購買于中國科學院細胞庫，RPMI-1640培養基購買于美國Invitrogen公司，胎牛血清、胰酶和青霉素-鏈霉素購買于美國Gibco公司，重組IL-6蛋白和褪黑素購買于美國Sigma公司，CCK-8試劑盒購買于上海碧云天公司，結晶紫染色液購買于北京索萊寶公司，RNAisoPlus試劑購買于大連寶生物，逆轉錄試劑盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR、Real-time PCR試劑盒TransStart Tip Green qPCR SuperMix和Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit(BCA)購買于北京全式金生物公司，RIPA裂解液購買于上海捷瑞公司，E-cadherin和Vimentin抗體購買于美國Abcam公司，Janus激酶2(JAK2)、磷酸化JAK2(p-JAK2)、信號傳導及轉錄激活因子3(STAT3)和磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體購買于美國Cell signaling technology公司。

二、實驗方法

1. CCK-8試劑盒檢測細胞活力：使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基培養SKOV3細胞，待細胞生長至對數期后，胰酶消化傳代，接種到96孔板中，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中過夜培養使細胞貼壁。加入不同濃度褪黑素(1、2、4、6、8 mM)和50 ng/mL IL-6繼續培養48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃細胞培養箱中繼續孵育1 h。使用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度值。根據測定的細胞活力，選擇兩個濃度，進行后續實驗。

2. 細胞培養與分組：將胰酶消化后過夜培養的SKOV3細胞隨機分成四組：對照組、IL-6組、IL-6+褪黑素低劑量組和IL-6+褪黑素高劑量組。其中對照組中不加任何處理，IL-6組中加入50 ng/mL IL-6，IL-6+褪黑素低劑量組中同時加入50 ng/mL IL-6和低濃度的褪黑素，IL-6+褪黑素高劑量組中同時加入50 ng/mL IL-6和高濃度的褪黑素。各組中加入不同試劑處理48 h，進行檢測。

3. Transwell檢測細胞遷移：將SKOV3細胞按照方法1處理48 h后，使用胰酶消化，然后將含有5×104個細胞的200 μL無血清RPMI-1640培養基加入到Transwell上室，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養24 h。取出小室，用棉簽將上層未遷移的細胞輕輕擦去，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色液染色15 min。然后在顯微鏡下隨機選擇5個視野拍照，計數每個視野中細胞數目的平均值即為每個小室中遷移細胞的數目。

4. 總RNA提取和Real-time PCR：將各組細胞中的培養基棄去，冰冷的PBS緩沖液清洗一次，然后按照RNAisoPlus溶液說明書操作提取細胞的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000分別檢測所提取總RNA的完整性以及濃度和純度。取1 μg純度較高且完整性好的RNA，使用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA后，按照Real-time PCR試劑盒操作行real-time PCR檢測，以GAPDH為內參，按照公式2-△△Ct計算目的基因E-cadherin和Vimentin的相對表達量。引物序列如下：E-cadherin上游引物5′-GTGCCTGAGAACGAGGCTA -3′，下游引物5′-CTGCATCTTGCCAGGTCCTT-3′； Vimentin上游引物5′-GACGGTTGAAACTAGAGATGG-3′，下游引物5′-GCTGGTAATATATTGCTGCA-3′；GAPDH上游引物5′-TGAAGACGGGCGGAGAGAAA-3′，下游引物5′-CCAATACGACCAAATCCGTTGAC-3′。

5. 總蛋白提取和Western blot檢測：取培養的各組細胞，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 g離心30 min，上清液即為所提取的總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，每孔取40 μg總蛋白，沸水浴將其變性后行SDS-PAGE電泳分離蛋白。利用半干轉法將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后加入提前稀釋好的一抗4℃過夜孵育，TBS溶液洗膜三次，使用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育45 min，TBST洗膜三次，加入ECL發光液后拍照，使用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

結 果

一、不同濃度褪黑素對IL-6誘導的卵巢癌SKOV3細胞活力的影響

用不同濃度褪黑素(1、2、4、6、8 mM)與50 ng/mL IL-6處理SKOV3細胞48 h，CCK-8檢測細胞活力，結果見表1。與對照組相比，IL-6處理后細胞活力增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；與IL-6單獨處理相比，除了1 mM褪黑素外，其它幾個濃度的褪黑素均能降低IL-6誘導的細胞活力，且具有劑量依賴性(P<0.05)。考慮到高濃度可能會對細胞產生毒性，后續實驗中褪黑素濃度使用2 mM和4 mM。

表1 各組細胞活力的比較(n=3)Table 1 Comparison of cell viability in different groups (n=3)

Note:*Compared to control,P<0.05;#Compared to IL-6,P<0.05

二、褪黑素對IL-6誘導的卵巢癌SKOV3細胞遷移的影響

Transwell檢測細胞遷移，結果如圖1和表2所示：與對照組相比，IL-6組中遷移細胞數目增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；與IL-6組相比，IL-6+褪黑素組中遷移細胞數目減少，且IL-6+褪黑素高劑量組中遷移細胞數目更低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組中細胞遷移情況Figure 1 Cell migration in different groups

GroupMigrated cell numberControl 74.7±6.5IL-6 137.7±10.3?IL-6+ low-melatonin 108.3±7.0#IL-6+ high-melatonin 95.0±8.9#

Note:*Compared to control,P<0.05;#Compared to IL-6,P<0.05

三、褪黑素對IL-6誘導的卵巢癌SKOV3細胞EMT的影響

Real-time PCR檢測各組細胞E-cadherin和Vimentin mRNA的表達，結果如表3所示：與對照組相比，IL-6組中E-cadherin mRNA表達降低、Vimentin mRNA表達升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與IL-6組相比，IL-6+褪黑素組中E-cadherin mRNA表達增加、Vimentin mRNA表達降低，且IL-6+褪黑素高劑量組中這些變化更加明顯，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

Western blot檢測各組細胞E-cadherin和Vimentin蛋白的表達量，結果如圖2和表3所示：與對照組相比，IL-6組中E-cadherin蛋白表達降低、Vimentin蛋白表達升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與IL-6組相比，IL-6+褪黑素組中E-cadherin蛋白表達增加、Vimentin蛋白表達降低，且IL-6+褪黑素高劑量組中這些變化更加明顯，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表達情況(n=3)Table 3 The mRNA and protein levels of E-cadherin and Vimentin in different groups (n=3)

Note:*Compared to control,P<0.05;#Compared to IL-6,P<0.05

圖2 各組E-cadherin和Vimentin蛋白表達Figure 2 The protein levels of E-cadherin and Vimentin in different groups

四、褪黑素能夠抑制IL-6誘導的JAK2/STAT3通路

Western blot檢測JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達，結果如圖3和表4所示：與對照組相比，IL-6組中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的值均增加，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與IL-6組相比，IL-6+褪黑素組中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的值降低，且IL-6+褪黑素高劑量組中兩比值變化更加明顯，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖3 各組p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3蛋白表達Figure 3 The protein levels of p-JAK2, JAK2, p-STAT3 and STAT3 in different groups

Groupp-JAK2/JAK2p-STAT3/STAT3Control 0.1±0.00.3±0.1IL-6 1.1±0.1?1.3±0.1?IL-6+low-melatonin 0.7±0.1#0.9±0.1#IL-6+high-melatonin 0.4±0.1#0.7±0.1#

Note:*Compared to control,P<0.05;#Compared to IL-6,P<0.05

討 論

研究顯示炎癥是卵巢癌細胞種植的一個關鍵因素[10]。IL-6是一個多效性的炎性細胞因子。它在多種腫瘤中表達上調，在腫瘤發生和轉移中發揮重要作用[11]。在卵巢癌患者的血清和腹水中發現IL-6的表達上調，其表達與患者的不良預后和卵巢癌細胞的浸潤、轉移特征相關[5]。IL-6還可以介導卵巢癌細胞的順鉑耐受，促進卵巢癌細胞的EMT[6,12]。本研究發現IL-6能夠增加SKOV3細胞的活力、遷移和EMT。

褪黑素具有多種生理功能，包括調節生理節律、免疫調節、抗炎和抗氧化等[13]。大量文獻也發現褪黑素對多種腫瘤具有明顯的抑制作用[14]。近年來褪黑素在卵巢癌中的作用也逐漸被發現。研究顯示褪黑素能夠抑制卵巢癌細胞的活力，抑制卵巢癌干細胞的遷移和侵襲、減少其EMT[8-9]。此外，褪黑素與癌細胞EMT的關系近年來也有相關研究。Wang等[15]的研究發現褪黑素能夠抑制胃癌細胞的EMT。外源性和內源性褪黑素都可以通過抑制EMT來抑制乳腺癌細胞的轉移特性[16]。本研究結果顯示褪黑素能夠抑制IL-6誘導的卵巢癌SKOV3細胞活力、遷移和EMT，且呈現出劑量依賴性。

STAT3是一個胞質轉錄因子，它可以被JAK家族的酶激活，調節細胞因子和生長因子信號。在正常組織中STAT3的活化是被嚴格控制的，但是在超過70%的實體瘤和血液腫瘤中，磷酸化激活的STAT3是組成型表達的[17]。JAK2/STAT3通路的活化能夠調節多種癌癥的發生和發展，促進癌癥的浸潤、轉移和EMT[18-19]。在卵巢癌中STAT3持續活化，抑制JAK/STAT3通路能夠抑制卵巢癌細胞的生長[17]。在癌細胞中發現，IL-6誘導的EMT與JAK2/STAT3通路的活化密切相關[19]。本研究中我們發現在SKOV3細胞中IL-6也能夠促進JAK2/STAT3通路的活化。Kang等[20]的研究顯示在巨噬細胞中褪黑素抑制內脂素誘導的誘導型一氧化氮合酶表達和一氧化氮產物與JAK2/STAT3通路的活化被抑制相關。本研究發現與IL-6組相比，p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的值在IL-6+褪黑素組中降低，且具有劑量依賴性。這表明在SKOV3細胞中褪黑素可以抑制IL-6誘導的JAK2/STAT3通路的活化。總之，本研究結果表明褪黑素能夠抑制IL-6誘導的卵巢癌SKOV3細胞EMT，這可能是通過抑制JAK2/STAT3通路的活化發揮作用的。本研究結果為褪黑素用于卵巢癌的治療提供了實驗依據。