樹鼩大腦皮層少突膠質前體細胞的分離鑒定

李明學, 黎曉慧, 黃 鑫, 王 璇, 張志成, 袁 園, 陸彩霞, 孫曉梅

(1. 中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所

樹鼩種質資源中心, 昆明 650118； 2. 昆明醫科大學, 昆明650500)

少突膠質細胞(oligodendrocytes, OLs)是中樞神經系統(central nervous system, CNS)髓鞘形成的唯一細胞, 起源于胚胎神經管腹側的神經上皮細胞[1]。其主要功能是產生髓鞘包繞神經軸突，維持神經沖動沿軸突跳躍性傳導。另外它還能分泌多種神經營養因子，支持神經元、膠質細胞的生長發育與存活[2]。OLs 在發育過程中, 大致經歷了少突膠質祖細胞、 少突膠質前體細胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)、未成熟少突膠質細胞(immature oligodendrocyte)和成熟少突膠質細胞(mature oligodendrocyte)幾個階段[3]，其形態、功能和表達產物呈現連續漸變過程，各發育階段沒有嚴格界限之分。越來越多研究表明,OLs 異常在CNS 脫髓鞘病變[4]、神經元損傷[5]、精神疾病等的發病機制中起著重要作用[6-8]。有研究者[9]曾嘗試將體外培養成熟的OLs 移植入髓鞘，對脫髓鞘病變的CNS 進行細胞治療。但是，成熟的OLs 缺乏增殖和遷移能力，移植后并不能使病變受損部位形成具有正常功能的髓鞘。已有研究[10]證明，體外培養的OPCs 在一定的條件下可定向分化成為成熟的OLs，將體外培養OPCs移植入體內并誘導其分化為成熟的OLs 形成具有正常功能的髓鞘。那么, OPCs 將有可能成為治療CNS 疾病或者損傷的理想細胞。所以，高純度、高質量OPCs 的體外培養是該研究工作的基礎。

樹鼩是一種新型的實驗動物，其生理、生化、解剖結構以及基因組等生物學特性比嚙齒類更接近于非人靈長類，且大腦較發達，已被用于神經系統相關疾病的研究[11-13]。目前，國內外對大鼠、小鼠OPCs 的培養報道[3-9、14-16]很多，有關樹鼩OPCs 的培養方法及研究尚無報道。本文探索樹鼩OPCs 的培養及鑒定方法，為利用樹鼩開展相關研究提供新的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生48 h內的樹鼩，由中國醫學科學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心提供[SCXK(滇)K2018-0002]； 實驗操作在本中心實驗設施內進行[SYXK(滇)K2018-0001]，并遵循實驗動物使用的3R 和福利倫理原則。

1.2 儀器與試劑

Forma A/B3(6Ft) 生物安全柜(美國，Forma)；CO2T/C 恒溫培養箱(美國，Thermo)； ECLIPSE Ti 倒置顯微鏡(日本，Nikon)； L8-80M 超速離心機(德國，Hermle)； ZD-85 數顯恒溫振蕩器(中國)：TOMY-SS-325 高壓滅菌鍋(日本, Tomy)； PBS(美國, Hyclone，SH30256.01B)； DMEM/F12 培養基(美國, Sigma, D8437)； FBS(Israel, BI, 04-001-1A)；胰蛋白酶(美國，Gibco)； D-Hank’s 液(美國，索萊寶，H1040)； DNase Ⅰ(德國，Applichem，D3778.0050)； Poly-D-lysine(美國，Sigma)； BSA(中國，Biosharp)； Anti-Myelin Basic Protein Antibody(髓鞘堿性蛋白, MBP； 美國, Sigma, M3821-100UG)；Anti-NG2 Antibody(硫酸軟骨素蛋白多糖4，NG2,英國, Abcam, ab183929)； 人睫狀神經細胞營養因子(CNTF； 美國, Cyagen, HEOPP-0301)； 三碘甲狀原氨酸(T3； 德國, Millipore, 642511-10MG)； Human FGF-base (bFGF； 美國, PeproTech, 100-18B-50)；B-27 Supplement(50X)(美國, Invitrogen, 17504044)；Cy3 標記的驢抗兔熒光二抗(德國，Millipore，AP182C)； 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI； 美國，Sigma)。

1.3 細胞培養液

混合培養液： DMEM/F12+10%FBS+1%雙抗；增殖培養液： DMEM/F12+10 ng/mL bFGF+1%FBS+2%B27+5 μg/mL 胰島素+1% 雙抗；分離液：DMEM/F12+0.02%EDTA+0.5%DNase I+5 μg/mL胰島素+1%雙抗； 分化培養液： DMEM/F12+30 ng/mL T3+10 ng/mL CNTF+2%B27+5 μg/mL 胰島素+1%雙抗。

1.4 方法

1.4.1 OPCs 分離 取新生48 h 內的樹鼩, 實施安死術后在體積分數75%乙醇中浸泡15 s，取出后用PBS 沖洗兩遍去乙醇。用眼科剪剪去頭皮，鑷子掀去頭骨, 彎鑷小心取出大腦, 置于裝有D-Hanks液(4 ℃預冷)的無菌培養皿中，洗滌2 遍，去除血跡。用鑷子從大腦腹側及邊緣小心地撕去腦膜和血管，去除腦干和小腦，夾取大腦皮層移入另一個裝有D-Hanks液的無菌培養皿中洗滌1次，以上都在冰板上操作。將大腦皮層移入一無菌小瓶中，用眼科剪盡量將大腦皮層剪碎成模糊狀，加入3 mL 0.25%胰酶和1 mL DNase I 消化，再用吸管吹打，制成細胞混懸液，放入37 ℃、5%CO2培養箱孵育5～10 min。加入混合培養液終止消化，吸管吹打混勻, 吸取細胞混懸液放入70 目細胞篩網中過濾一次, 使之分散成單個細胞。收集到15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心10 min，棄去上清，留沉淀，加入混合培養液重懸細胞沉淀。將細胞懸液接種于普通25 cm2的培養瓶，放入培養箱中培養1 h，輕輕吸出細胞懸液(以去除已貼壁的成纖維細胞和較大的組織碎片)接種于預先用PDL 處理過的25 cm2的一次性細胞培養瓶中，然后將培養瓶放入培養箱培養。

1.4.2 OPCs增殖培養與純化 原代混合細胞培養5 d 后，加入增殖液培養, 每日換液。2 d 后, 去除增殖培養液，PBS 清洗2 次, 加入分離液, 放入培養箱孵育10～15min。用吸管吸取培養液, 輕輕吹打細胞培養面，而后吸取細胞混懸液放入40目細胞篩網中過濾一次, 1 000 r/min 離心10 min，棄上清，留沉淀，加入混合培養液，將細胞懸液接種于未處理過的6孔板中, 放入培養箱中培養1 h。之后輕輕地吸取上清到PDL處理過的6孔板中培養1 min。最后輕輕吸出細胞懸液接種于預先用PDL 處理過的6 孔板中，然后放入培育箱過夜培養。棄混合培養液, 加入增殖液, 繼續培養。

1.4.3 OPCs定向誘導分化 純化過后的OPCs培養3 d 后，加入分化培養液定向分化，最后終止培養，吸出殘余培養基，進行免疫熒光鑒定。

1.4.4 細胞形態學觀察 取不同時間段培養的細胞，用倒置顯微鏡觀察細胞形態及生長狀態，并拍照記錄。

1.4.5 細胞免疫熒光鑒定 去除培養液, 用PBS漂洗3 次，每次2 min； 質量分數4% 多聚甲醛固定20 min, PBS 漂洗3 次, 每次2 min； 0.5%Triton X-100室溫穿孔20 min, PBS漂洗3次，每次2 min；5%的山羊血清室溫封閉30 min，PBS 漂洗3 次，每次2 min； 對少突膠質前體細胞和OPCs 分別滴加稀釋好的抗NG2、MBP(1∶200 稀釋)一抗，對照孔加PBS 代替一抗，4 ℃過夜孵育，PBS 漂洗4 次，每次3 min； 避光條件下，加入Cy3 標記的驢抗兔熒光二抗，37 ℃孵箱1h，PBS 漂洗4 次，每次3 min； 滴加DAPI 避光孵育5 min, PBS清洗3 次, 每次2 min； 吸走液體, 加入抗熒光淬滅劑(1∶500 稀釋), 在熒光顯微鏡下觀察并拍照。1.2.6 MTT法測定OPCs生長曲線 純化培養后,選取單層生長的細胞制成細胞懸液, 培養液稀釋細胞濃度至1.5×104細胞/mL, 以每孔100 μL 接種于96 孔培養板中, 設2 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h 和96 h 共9 組，每組3 個復孔，空白調零組為不接種細胞只加培養液,于37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養，分別按設置的時間點，每孔加入MTT 20 μL, 繼續培養4 h, 去除培養液, 每孔加入200 μL DMSO, 37 ℃下溶解30 min，選擇波長490 nm，以空白組調零，在酶標儀上測定各孔吸光度(A)值。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

經胰酶消化后剛接種的細胞懸浮于培養液中，呈圓形，折光性較強。接種10 min 就可見少量細胞開始貼壁，貼壁1 h 后轉移至經PDL 處理過的培養瓶中, 8 h 后大部分細胞已貼壁。培養3 d后, 在熒光顯微鏡下觀察, 細胞表面開始長出突起，且多數細胞的體積較大，緊貼于瓶底生長,胞核較大，呈圓形或長條形，細胞扁平狀有較粗大的突起。少數為體積較小，胞體呈圓形或橢圓形, 具有單極或雙極細小突起的強折光性的細胞(圖1A ↑)。加入增殖培養液繼續培養2 d 后，OPCs不斷分裂增殖并呈現出典型的雙極或三極形態、細胞核大、胞體較小、折光性較弱且呈圓形或橢圓形(圖1B ↑和1C)。加入分化培養液繼續培養，OPCs分化成未成熟(圖1D↑)或成熟OLs(圖1E↑)時，細胞突起數量明顯增加，突起變長且有分支，分支常交互形成“蜘蛛網”樣，極為茂密。

2.2 細胞免疫熒光染色

NG2 是OPCs的特異性標志蛋白，而MBP是成熟OLs 特異性標志蛋白[17]。分別使用這兩種蛋白的抗體對純化后的OPCs及分化后的OLs進行免疫熒光染色，再使用攜帶Cy3 的熒光二抗標記，DAPI 染核。結果顯示陽性細胞發紅色熒光，細胞核被染為藍色(圖2，圖3)。

對OPCs進行NG2特異性抗體免疫熒光染色,結果顯示大部分細胞為NG2 陽性的OPCs(圖2)，形態為兩極或三極突起狀，還存在少量NG2陰性的雜細胞。

A： 10 倍, B： 20 倍圖 2 樹鼩OPCs 的NG2 免疫熒光染色Figure 2 Immunofluorescence staining of NG2 of tree shrew OPCs

對OLs 進行MBP特異性抗體免疫熒光染色，結果顯示一部分細胞為MBP陽性的OLs(圖3)，形態為“蜘蛛網”樣的突起，但也存在較多的MBP陰性的雜細胞。

2.3 OPCs 生長曲線

在PDL 處理過6 孔板中，OPCs 可以在2 h內全部貼壁，OPCs 從兩極開始伸出突起，在12 h 內細胞增殖相對較慢，而在之后的時間里，出現明顯擴增，而且呈現OPCs 的典型形態。在12～60 h，細胞增殖明顯，在此之間，細胞進入對數生長期。72 h 后，細胞增殖變緩，細胞數量逐漸減少，細胞開始不再增多而進入分裂終期。根據每日測得的A490，取平均值作生長曲線(圖4)。

圖 4 樹鼩OPCs 生長曲線Figure 4 The growth curve of oligodendrocyte progenitor cell

3 討論

在CNS疾病或者損傷時，不僅可以導致損傷中心附近區域神經元大量死亡，同時還能導致OLs 壞死和凋亡，最終導致軸突脫髓鞘化以及神經功能恢復困難。移植OLs并不能有效形成髓鞘,再加上對髓鞘發育/再生過程中的分子機制還沒有完全了解，導致這類疾病迄今還沒有有效治療方法。OPCs 是CNS 中一類干細胞樣的細胞[15]，它可以不斷增殖，并且最終可分化為OLs、2 型星形膠質細胞以及神經元[16]。因此有研究者[10]猜測OPCs 可能是治療CNS 疾病或者損傷的理想細胞。樹鼩大腦較發達，且比大鼠、小鼠更接近靈長類動物，是研究神經系統疾病較為理想的實驗動物。分離培養高純度、高質量的樹鼩OPCs是開展相關神經系統疾病研究的基礎。

本實驗借鑒差速貼壁法以及傳統的恒溫搖床分離法[9,14,15]和化學分離法[13]來純化體外培養的OPCs。OPCs 主要存在于大腦皮層，但從大腦皮層獲取的原代細胞種類中，不僅有OPCs，還有大量的星形膠質細胞、小膠質細胞、少突膠質細胞、神經元、成纖維細胞、血管內皮細胞以及尚不清楚的雜細胞[9]，因此，去除以上細胞污染、獲得純化的OPCs 是本實驗的關鍵。本試驗采用出生48 h 內樹鼩，優點之一是此時樹鼩的腦部還沒有進一步分化發育，所含的OPCs 大部分還處于增殖階段，細胞活性高，易于體外培養[9]；其次，其腦膜易于剝離，能有效去除原代培養中成纖維細胞和血管內皮細胞污染。去除腦膜、腦干等組織后的大腦皮層，使用胰酶和DNase I 聯合消化來獲得細胞懸液。通過對比單獨采用胰酶或胰酶和DNase I 聯合使用，表明兩者聯合使用，能降低細胞懸液的粘稠度，并能更好形成單細胞懸液。

利用OPCs 貼壁速度明顯慢于其他細胞的特點，對原代細胞進行多次差速貼壁處理，可有效降低雜細胞污染，例如，成纖維細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞等。在混合培養5 d 后，可更換培養液，加入增殖培養液。增殖培養液中低濃度血清以及細胞因子，不僅能抑制其他雜細胞生長，還可以促進OPCs 增殖。

首次分離純化時，通過對比兩種不同分離方法，可清晰地發現化學分離法要優于恒溫搖床分離法。通過化學分離法純化，可以減少對OPCs機械損傷，尤其是對OPCs 突觸的損傷，大大提高了細胞活性，OPCs 的存活率可達到95%。其次，大大縮短分離時間, 簡化了純化步驟，一般恒溫搖床分離需要20 h左右, 而化學分離只需孵育20 min。但化學分離法也存在缺點，孵育后需要用槍頭吸取培養液，輕輕吹打細胞面，這能讓OPCs 充分地分離，但也導致一些雜細胞被吹打下來，影響了OPCs 的純度。

因此，對于首次分離純化的混合細胞，需再次采用兩次差速貼壁法進一步純化OPCs。首先，最先純化的細胞，經過離心稀釋成細胞懸液，在未被PDL處理過的培養瓶或培養板里孵育1 h，能有效除去較大和易貼壁細胞。其次，取上清細胞懸液接種于PDL處理過的培養瓶或培養板中再孵育1 min，能進一步除去較難貼壁的雜細胞，但同時也會損失部分OPCs。最后，將純化后細胞懸液接種于PDL處理過的培養瓶或培養板培養。純化時，全過程都使用混合培養液，其中的高濃度血清能減弱對OPCs 的損傷，提高細胞活性。純化后繼續培養，OPCs 能在2 h 內完全貼壁，再換培養液進行增殖或分化培養。

在原代未純化細胞中, 可以清晰觀察到OPCs形態主要以兩極或三極的突起為主，胞體較小且折光性強。經過純化和分化培養后，觀察到OPCs 突起增多, 并且相互連接成“蜘蛛網”狀,胞體無明顯變化, 與文獻[3-9,14-16]的實驗報道相似(圖1C～1E)。

OPCs 增殖、分化和髓鞘形成過程受到細胞內部性質、細胞生存周期和其他細胞分泌(神經元、間充質干細胞、神經膠質細胞、心肌細胞等)信號分子等因素的影響[3]。在OPCs 增殖、分化等培養液中加入相應的物質和細胞因子, 可促進其增殖、分化。有研究表明, PDGF-aa 和bFGF聯合使用[3]、巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)[15]和15% B104 條件培養基[14]具有促進OPC 增殖效應。分化培養時，OPCs 缺少增殖能力，而無法除去的雜細胞也開始增殖，再加上OPCs 還能分化成2 型星形膠質細胞，OLs 其純度開始下降，這是定向分化的最大問題。有研究證明，分化液中人睫狀神經細胞營養因子(CNTF)，不僅可誘導OPCs 分化成少突膠質細胞，也能誘導OPCs 分化成2 型星形膠質細胞[18]。因此建議，先讓細胞分化4 d，之后再加入CNTF 來提高細胞存活率，也可以限制OPCs 分化方向。而對于一些較難除去的雜細胞，只能增加差速貼壁時間，或者添加能抑制其增長的細胞因子。

綜上所述，本實驗采用化學分離法和差速貼壁法來分離純化OPCs，并對分離后細胞再進行二次差速貼壁純化，能獲得活性高且純度高達97%的OPCs，且較其他方法如恒溫搖床法、抗體免疫篩選法[17]簡便、可靠、易于推廣。本研究為樹鼩OPCs體外分離培養進行了實驗性探索，也為今后開展樹鼩CNS 疾病模型奠定了基礎。