Tg2576 小鼠的行為和病理特征觀察

關(guān)雅倫, 劉書華, 黃忠強(qiáng), 李韻峰, 李雪嬌, 李 舸, 張 鈺

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所, 廣州510663)

阿爾茲海默癥(AD)是一種以認(rèn)知障礙和記憶力減退為臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。目前AD 已成為全球老齡化社會(huì)中威脅老年人健康甚至生命的第一大殺手，至今缺乏有效的治療方法。因此，一直以來(lái)AD 都是神經(jīng)病學(xué)研究的熱點(diǎn)，而基于AD 相關(guān)致病基因構(gòu)建的各種遺傳工程小鼠成為AD 疾病研究不可或缺的模式動(dòng)物，目前國(guó)際上常用的AD 小鼠有Tg2576、APP23、APP/PS1、3×Tg-AD 和5×FAD。其中, Tg2576小鼠是1996年由Hasio等[1]構(gòu)建的能產(chǎn)生認(rèn)知障礙和A β斑塊的轉(zhuǎn)基因AD 小鼠模型，是最早應(yīng)用于AD 研究的模式動(dòng)物之一。該小鼠遺傳背景為C57BL/6J 和 SJL小鼠的雜交系，通過(guò)將編碼人的APP695 氨基酸異構(gòu)體基因序列轉(zhuǎn)入小鼠基因組后，小鼠過(guò)表達(dá)產(chǎn)生人APP (Lys670-＞Asn670,Met671-＞Leu671)突變體(瑞典型突變位點(diǎn)), 最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)AD 樣的臨床和病理改變。由于Tg2576 小鼠遺傳背景為雜交系, 當(dāng)雜交系小鼠作為親代進(jìn)行長(zhǎng)期繁殖后由于基因的隨機(jī)分離，將導(dǎo)致子代個(gè)體之間遺傳背景出現(xiàn)差異[2], 但這種差異是否影響動(dòng)物表型目前并不清楚, 這也成為近年來(lái)Tg2576小鼠較其它單一遺傳背景的AD轉(zhuǎn)基因小鼠較少被應(yīng)用于科學(xué)研究關(guān)鍵因素之一。本文作者針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)并長(zhǎng)期繁使用的Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠, 通過(guò)行為和病理表型分析，初步探討長(zhǎng)期繁殖可能對(duì)該小鼠AD 表型產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

使用1 只12 周齡雄性Tg2576 小鼠(廣東藥科大學(xué)王麗京教授惠贈(zèng))和60只5周齡雌性C57BL/6小鼠，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2013-0002], 過(guò)體外受精、胚胎移植方式，獲得同期出生的6周齡SPF級(jí)Tg2576雌性小鼠和同窩對(duì)照C57BL/6 雌性小鼠各40 只(體質(zhì)量18～20 g)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所SPF 級(jí)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(粵)2016-0122]，所有小鼠分別飼養(yǎng)至6 月齡、9 月齡、12 月齡和15 月齡后, Tg2576小鼠和對(duì)照小鼠隨機(jī)各選取10 只進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 飼養(yǎng)期間動(dòng)物自由采食飲水，12 h∶12 h 循環(huán)燈光,恒定濕度, 室溫(23±2) ℃。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所(AAALAC認(rèn)證機(jī)構(gòu))動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)(IACUC編號(hào)2014027)。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

鼠抗Aβ 1-40 抗體，鼠抗Aβ 1-42 抗體(美國(guó)Biolegend公司), 兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(美國(guó)Millipore 公司)，硫磺素(美國(guó)Sigma-Aldrich 公司)，鼠鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶免疫組織化學(xué)試劑盒(中國(guó)康為世紀(jì)生物科技有限公司)，抗兔Alexa Fluor 555免疫熒光二抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司),鼠Aβ 1-40 ELISA檢測(cè)試劑盒，鼠Aβ 1-42 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Invitrogen Life Technologies公司),多聚甲醛、 無(wú)水乙醇和二甲苯(中國(guó)上海化學(xué)試劑有限公司), Triton X-100(中國(guó)上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

Morris水迷宮(中國(guó)上海欣軟信息科技有限公司)，切片機(jī)、冷凍切片機(jī)、DM3000 正置顯微鏡和TCS SP5 激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica 公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)。

1.3 方法

1.3.1 Morris 水迷宮 Morris 水迷宮由一個(gè)圓形水池(直徑120 cm，高度50 cm)和一個(gè)白色圓形平臺(tái)(10 cm)組成，水池周圍由1 m 高的布簾圍蔽，水池頂部放置攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡。圓形水池被等分為4 個(gè)象限，每個(gè)象限的水池壁繪制幾何圖形便于動(dòng)物進(jìn)行定位，實(shí)驗(yàn)前注水并將水溫保持在(24±1)℃，在第一象限中心固定放置白色圓形平臺(tái)，并調(diào)節(jié)高度至水面下1 cm處。小鼠在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先放置于平臺(tái)上觀察適應(yīng)環(huán)境，正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，連續(xù)進(jìn)行5 d，前4 d，小鼠每日分別從4 個(gè)不同象限的固定位置入水，觀察記錄動(dòng)物找到平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)，如果在60 s 內(nèi)找不到平臺(tái)，動(dòng)物則被輕輕地引導(dǎo)到平臺(tái)上，每次試驗(yàn)結(jié)束后小鼠留在平臺(tái)上休息10 s，再進(jìn)行下一個(gè)象限的測(cè)試, 前4 d主要測(cè)試動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力。第5 日，將第一象限的平臺(tái)拆除，動(dòng)物從對(duì)側(cè)象限入水，進(jìn)行了一次60 s 的單一探測(cè)試驗(yàn)，觀察記錄動(dòng)物穿越平臺(tái)位置的次數(shù)，主要測(cè)試動(dòng)物的記憶能力。動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡自動(dòng)化軟件進(jìn)行跟蹤并分析。

1.3.2 腦組織樣品Aβ1-40 和42 免疫組織化學(xué)染色 小鼠麻醉后用生理鹽水從心臟進(jìn)行灌注, 取右半腦在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定過(guò)夜, 腦組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后, 包埋成石蠟組織塊。石蠟塊修塊后4 μm 切片, 在45 ℃水中展片后，貼于明膠玻片上放入烘箱中烘烤過(guò)夜用于后期染色。組織切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水、抗原修復(fù)后, 按照鼠鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶免疫組化試劑盒操作說(shuō)明，滴加山羊血清封閉, 加入1∶400 稀釋的一抗鼠抗Aβ 1-40 抗體或鼠抗Aβ 1-40 抗體孵育過(guò)夜后，經(jīng)PBS 充分漂洗后, 滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗工作液室溫孵育30 min, 經(jīng)PBS 漂洗后，加入過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育30 min，經(jīng)PBS再次漂洗后，加入二氨基聯(lián)苯胺顯色工作液，并在顯微鏡下觀察顯色。顯色完成后，將組織切片放入自來(lái)水中終止顯色，之后組織切片經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水透明，封片后在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。

1.3.3 ELISA 檢測(cè)腦組織樣品Aβ 1-40 和Aβ 1-42表達(dá) 小鼠麻醉后用生理鹽水從心臟進(jìn)行灌注，取左半腦準(zhǔn)確稱量后置于預(yù)冷的PBS 中，冰上充分勻漿，離心后獲得上清, 按照鼠Aβ 1-40 和Aβ 1-42 ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求，將上清中的抗原與預(yù)先包被Aβ 1-40抗體或Aβ 1-42抗體的酶標(biāo)板進(jìn)行孵育, 之后加入HRP標(biāo)記的二抗與一抗進(jìn)行結(jié)合, 形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物, 經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腦組織中的Aβ 1-40 和42 表達(dá)濃度。

1.3.4 腦組織樣品星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色 小鼠麻醉后用生理鹽水從心臟進(jìn)行灌注, 取右半腦在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定過(guò)夜, 之后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%蔗糖溶液中再次過(guò)夜。腦組織過(guò)夜后在-20 ℃冰凍切片機(jī)下10 μm 連續(xù)切片。在進(jìn)行免疫熒光前, 冰凍切片經(jīng)過(guò)0.3%的Triton X-100 破膜, 并用10%血清在室溫下封閉1 h。之后加入一抗兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體并在4 ℃避光孵育過(guò)夜, PBS漂洗后選擇抗兔Alexa Fluor 555 免疫熒光二抗在37 ℃下避光孵育1 h, 之后組織切片經(jīng)過(guò)硫磺素染Aβ 沉淀后, 在激光共聚焦顯微鏡下根據(jù)發(fā)光基團(tuán)選擇激發(fā)光進(jìn)行觀察拍照, 所有照片應(yīng)選擇相同的曝光時(shí)間, 最后利用顯微鏡自帶軟件對(duì)進(jìn)行合成分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x-± s 表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tg2576 小鼠AD 樣行為特征變化

與對(duì)照小鼠比較, 從12 月齡開(kāi)始, Tg2576 小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)測(cè)試階段，定位航行逃避潛伏期時(shí)間在1～4 d 明顯出現(xiàn)分離，15 月齡時(shí)逃避潛伏期時(shí)間分離更明顯(圖1)。在第5 日拆除第一象限平臺(tái)后，從9 月齡開(kāi)始，Tg2576 小鼠

A： 6 月齡； B： 9 月齡； C：12 月齡； D： 15 月齡； 與對(duì)照小鼠比較： *P＜0.05； **P＜0.01圖 1 不同月齡Tg2576 小鼠逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)

在水迷宮實(shí)驗(yàn)的記憶測(cè)試階段比對(duì)照組小鼠穿越平臺(tái)位置的次數(shù)開(kāi)始減少, 15月齡穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(圖2)。

2.2 Tg2576 小鼠腦組織Aβ 斑塊的變化

圖 2 不同月齡Tg2576 小鼠穿越平臺(tái)實(shí)驗(yàn)

對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行Aβ 1-40和Aβ 1-42免疫組織化學(xué)染色顯示，與對(duì)照小鼠相比，12 月齡的Tg2576 小鼠腦組織中可見(jiàn)明顯的Aβ 斑塊的沉積，毒性蛋白沉積物主要集中在大腦皮層(圖3A)和海馬區(qū)(圖3C), 且大腦皮層的Aβ 斑塊沉積物相對(duì)較多，同時(shí), 血管周圍也出現(xiàn)典型Aβ 斑塊的沉積(圖3B)。對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行Aβ 1-40 和Aβ 1-42蛋白定量分析表明，Tg2576 小鼠腦組織Aβ 1-40蛋白從12月齡開(kāi)始出現(xiàn)顯著升高，蛋白水平表達(dá)是同齡對(duì)照小鼠20 倍以上(圖4A)。而Aβ 1-42 蛋白則從9 月齡開(kāi)始出現(xiàn)顯著升高，蛋白水平是同齡對(duì)照小鼠17 倍以上(圖4B)。

A： 皮層, 比例尺100 μm； B： 皮層血管，比例尺100 μm； C： 海馬, 比例尺50 μm圖 3 12 月齡Tg2576 小鼠大腦皮層Aβ 斑塊免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

A： Aβ 1-40； B： Aβ 1-42； 與對(duì)照小鼠比較, *P＜0.05； **P＜0.01圖 4 不同月齡Tg2576 小鼠腦組織Aβ 1-40 和Aβ 1-42 蛋白檢測(cè)

2.3 Tg2576 小鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況

對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色和硫磺素染色后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照小鼠相比，從9月齡開(kāi)始，Tg2576小鼠在大腦皮層區(qū)開(kāi)始出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，隨著年齡增大，在大腦皮層區(qū)和海馬區(qū)均能夠觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，特別是在大腦皮層區(qū)出現(xiàn)大量星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集，通過(guò)與硫磺素共染發(fā)現(xiàn)，這些激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞主要聚集在Aβ 斑塊附近(圖5)。

3 討論

Tg2576 小鼠表型與AD臨床癥狀具有一定的相似性，表現(xiàn)在： 大量與淀粉樣斑塊產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白泛素化； 神經(jīng)元出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良； α突觸核蛋白異常引起神經(jīng)元軸突退變； 膽堿能神經(jīng)元和腎上腺素能神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少，這些病理變化主要發(fā)生在淀粉樣斑塊和認(rèn)知缺陷之前，類似于AD 前驅(qū)期在人類中發(fā)生的認(rèn)知缺陷。同時(shí)，該小鼠還表現(xiàn)出慢性神經(jīng)炎癥，睡眠障礙等表型。但該小鼠同樣也表現(xiàn)出與人的AD 不一致臨床病理特征，例如，認(rèn)知缺陷衰退較臨床AD病人不顯著，無(wú)廣泛的神經(jīng)元丟失，無(wú)神經(jīng)纖維纏結(jié)形成，晚期糖基化終產(chǎn)物以及葡糖糖代謝顯著降低等。因此，該轉(zhuǎn)基因小鼠模型可能更適合臨床AD發(fā)生早期階段研究，還無(wú)法完全模擬AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的臨床病理特征[3]。

GFAP 染色星形膠質(zhì)細(xì)胞(紅色熒光), 硫磺素染色Aβ 斑塊(綠色熒光)圖 5 不同月齡Tg2576 小鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況

對(duì)過(guò)去20年P(guān)UBMED數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示，1998 年至今有994 篇研究論文使用了Tg2576小鼠, 但從2004 年開(kāi)始，每年使用該小鼠發(fā)表的文章在50 篇左右。與常用的APP/PS1 小鼠相比，從2013年后, 使用Tg2576小鼠發(fā)表的研究論文數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能與該小鼠是在繁育使用中個(gè)體遺傳背景存在差異, 且遺傳背景影響著繁殖和行為變化有關(guān)。Lassalle等[4,5]將具有C57BL/6和SJL 雜交背景的Tg2576 小鼠與C57BL/6 回交后，連續(xù)3 代產(chǎn)仔數(shù)由6 只至4 只，最后下降至0； 而與CBA小鼠回交3代，每代產(chǎn)仔數(shù)平均在4.7只、5.3只和3.7只； 與C57BL/6和SJL(B6SJL)雜交1代小鼠繁殖6代, 每代產(chǎn)仔數(shù)平均在10.3 只、8.1只、5 只、5.9 只、7 只和7 只。由此可見(jiàn)，Tg2576小鼠維持B6SJL 混合背景具有較好的繁殖能力。

本研究選用長(zhǎng)期在本實(shí)驗(yàn)室繁殖保種的Tg2576雄鼠, 通過(guò)體外受精-胚胎移植方式獲得本實(shí)驗(yàn)所需的小鼠, 并未出現(xiàn)在自然交配中無(wú)法繁育的情況。其次, 因遺傳背景所致雄性Tg2576 小鼠攻擊性較強(qiáng), 很難群居飼養(yǎng)[6], 本研究中, 長(zhǎng)期繁育后產(chǎn)生的Tg2576小鼠在飼養(yǎng)過(guò)程中仍然出現(xiàn)群居和諧性較差的情況，無(wú)論雌性或雄性都容易出現(xiàn)打斗現(xiàn)象, 該小鼠的這種特性對(duì)于需要長(zhǎng)期進(jìn)行的AD 相關(guān)研究造成較大困難。此外, 該小鼠攜帶Pde6brd1視網(wǎng)膜變性基因, 易造成個(gè)別動(dòng)物對(duì)光敏感或失明，因此，需要在進(jìn)行行為評(píng)價(jià)前排除。

Tg2576 小鼠AD樣行為學(xué)表型主要表現(xiàn)為年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙。Tg2576 小鼠最早在6 月齡開(kāi)始出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷，以及環(huán)境恐懼現(xiàn)象，也有認(rèn)為, 該小鼠空間學(xué)習(xí)損傷出現(xiàn)在12個(gè)月以后[7]。本研究中，長(zhǎng)期繁育的Tg2576 小鼠后代從9 月齡開(kāi)始出現(xiàn)認(rèn)知行為損傷，仍然保持了該小鼠的AD 樣行為學(xué)特性。Hsiao 等[1]構(gòu)建的Tg2576 小鼠Aβ 斑塊的沉積主要出現(xiàn)在前額葉、顳葉、嗅皮質(zhì)區(qū)、海馬和小腦部位, 9～12 月齡鼠上出現(xiàn)了與年齡相關(guān)的淀粉樣斑塊, 11～13月齡小鼠的Aβ 1-42/43 的產(chǎn)生比2～8 月齡增加14 倍以上。本研究中, Tg2576 小鼠腦皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)典型的Aβ沉淀發(fā)生在9月齡以后與文獻(xiàn)報(bào)道較為一致。鑒于Tg2576 小鼠隨著月齡增大, 能產(chǎn)生典型的Aβ 斑塊, 以及大量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生特點(diǎn)[8],目前該小鼠仍然是應(yīng)用于Aβ斑塊清除以及星形膠質(zhì)細(xì)胞參與AD 發(fā)生等研究中較好的模式動(dòng)物，此外，Tg2576小鼠也被應(yīng)用于乙酰膽堿酯酶抑制劑[9]、美金剛胺和加蘭他明[10]以及疫苗的藥效評(píng)價(jià)中, 然而盡管使用Tg2576 小鼠進(jìn)行AD 治療藥物臨床前評(píng)價(jià)顯示有效, 但在臨床應(yīng)用中實(shí)際應(yīng)用中仍然無(wú)法獲得陽(yáng)性結(jié)果, 這也是目前使用的AD基因工程小鼠在藥效評(píng)價(jià)中面臨的主要問(wèn)題。

綜上所述，我們對(duì)長(zhǎng)期雜交繁育的Tg2576進(jìn)行行為和病理結(jié)果檢測(cè)與文獻(xiàn)報(bào)道未出現(xiàn)明顯的差異，動(dòng)物仍然能夠表現(xiàn)出典型的學(xué)習(xí)記憶功能衰退、Aβ 斑塊沉積以及星形膠質(zhì)細(xì)胞激活等表型，但由于長(zhǎng)期繁育后該小鼠仍然攜帶SJL 小鼠背景，群養(yǎng)和諧性較差，導(dǎo)致長(zhǎng)期飼養(yǎng)困難，群居性較差對(duì)于開(kāi)展行為評(píng)價(jià)可能產(chǎn)生較大影響，這也成為近年來(lái)Tg2576 小鼠應(yīng)用較少的重要原因之一。