Fhl1 基因敲除對不同年齡小鼠腓腸肌肌纖維分化和自噬水平的影響

苗佳寧, 劉 波, 丁晶晶, 王莉莉

(中國醫科大學附屬盛京醫院實驗研究中心, 沈陽110004)

(遼寧省環境與代謝疾病動物模型研究與應用重點實驗室, 沈陽110004)

FHL1(Four and a half LIM domains protein 1)屬于LIM 蛋白家族成員之一。人類FHL 的LIM 蛋白家族包括5 個成員，FHL1、FHL2、FHL3、FHL4 和FHL5[1-4]。人類Fhl1 基因位于Xq27.2, 含有5 個外顯子，cDNA 全長2 441 個堿基，編碼280個氨基酸[5,6]。 FHL1在骨骼肌和心肌中高水平表達，在細胞骨架重排、纖維形成和肌小節的組裝中發揮一定作用[7-9]。近年研究[10-12]表明，Fhl1是人類6 種X 連鎖肌病的致病基因，包括： X 連鎖遺傳性的肩腓型肌病、X 連鎖姿勢性肌肉萎縮型肌病、X 連鎖的還原體肌病、埃-德二氏肌營養不良、X 連鎖退縮性的埃-德類似綜合征和脊柱強直綜合征。除了上述的X 連鎖肌病外, 有研究[13]表明Fhl1基因的表達下調和先天性馬蹄內翻足的肌肉異常表型的形成有關。此外, 在部分特發性炎性肌病的患者體內出現FHL1抗體, 引起骨骼肌自身免疫性損傷, 導致患者肌肉萎縮, 發音、吞咽困難[14]。因此, FHL1 對骨骼肌發育起到重要作用，Fhl1 基因的突變和表達異常可以引起各種肌肉表型異常。探討Fhl1基因敲除(FHl1-ko)小鼠骨骼肌表型的分子機制將為揭示人類FHL1肌病的發生機制奠定一定基礎。因此，課題組前期應用TALEN 技術制作了Fhl1-ko 小鼠, 并且發現2.5 月齡的Fhl1-ko小鼠脛骨前肌中肌原纖維和肌原纖維間的排列紊亂和Foxo1 介導的自噬水平和mTOR激活的蛋白合成有關[15]。Fhl1-ko 對不同年齡小鼠腓腸肌肌纖維分化和自噬水平的影響, 目前尚未見報道。因此, 本研究探討了Fhl1-ko 對2.5 月齡(青年)和8月齡(成年)小鼠腓腸肌中自噬水平和肌纖維類型的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

TALEN 技術制作的Fhl1-ko C57B6 小鼠，具體制作過程和基因型鑒定方法見文獻[15]。野生型(wt)C57B6雄性小鼠購自遼寧長生生物技術股份有限公司[SCXK(遼)2015-0001]。wt 型和Fhl1-ko 型雄性C57B6小鼠飼養于中國醫科大學附屬盛京醫院實驗中心SPF 級動物飼養室[SYXK(遼)2017-0004]。

1.2 主要儀器設備和試劑

S1000Thermal cycler PCR 儀(美國Bio-rad 公司)，LightCycler 480 II 熒光定量PCR 儀(瑞士Roche 公司)，SynergyH1 全功能微孔板檢測儀(美國BioTek 公司)，Amersham Imager 600 化學發光成像系統(日本GE 公司)。

TRIZOL(美國Invitrogen 公司)，反轉錄試劑盒、SYBR 染料(日本Takara 公司)，總蛋白提取試劑盒(美國Invent 公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒、化學發光檢測試劑盒(美國Thermo 公司)，GAPDH抗體 (中國上海康成公司)， LC3B抗體(美國CST 公司)，Beclin1 抗體(英國Abcam 公司)，P62 抗體、FHL1 抗體(瑞士Sigma 公司)。

1.3 Western blotting

2.5 月齡和8 月齡的wt 型和Fhl1-ko型雄性小鼠各5 只, 小鼠麻醉后切取腓腸肌。應用Invent 總蛋白提取試劑盒提取30 mg肌組織的總蛋白, 具體操作步驟參照試劑盒說明書。應用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測提取蛋白質濃度, 應用12.5%的SDSPAGE 進行蛋白質的凝膠電泳。Western bloting 所用的一抗稀釋比例如下GAPDH (1∶10 000), LC3B(1∶1 000), Beclin1(1∶500)，P62(1∶500)，FHL1(1∶2 000)。

1.4 定量PCR

用T R IZ O L 試劑提取各組小鼠腓腸肌總RNA。用反轉錄酶和 Oligo(dT)20 引物合成cDNA。定量 PCR 的引物序列見表 1。在定量PCR 過程中，每個基因重復擴增 3 次， 基因的相對表達水平應用 2－△△Ct方法計算。PCR 產物經 2%瓊脂糖膠電泳分離并拍照。

2 結果

2.1 不同基因型的小鼠鑒定結果

鼠尾基因組DNA經PCR擴增后，直接測序。不同基因型的小鼠基因組DNA 測序結果見圖1。

2.2 不同月齡Fhl1-ko 小鼠腓腸肌自噬水平變化

與2.5 月齡wt 的小鼠腓腸肌相比，2.5 月齡Fhl1-ko 小鼠腓腸肌肌中LC3B 和Beclin 1 明顯增加，P62 卻并沒有明顯降低。而與8 月齡wt 小鼠的腓腸肌相比, 8 月齡Fhl1-ko 小鼠腓腸肌中LC3B明顯增加, 但是增加的幅度沒有2.5月齡小鼠中明顯。同時, 8月齡Fhl1-ko小鼠腓腸肌中Beclin1表達水平改變沒有統計學意義, P62 的表達水平明顯增加(圖2)。

表 1 定量PCR 引物序列

wt 為野生型小鼠, ko 為Fhl1-ko 型小鼠； 下圖同圖 1 不同基因型的小鼠鼠尾基因組DNA 測序鑒定結果

2.3 不同月齡Fhl1-ko 型小鼠腓腸肌肌纖維相對表達量

2.5月齡小鼠中, Fhl1-ko可以明顯降低腓腸肌中MYH IIA, MYH IIX 型肌纖維相對表達量，明顯增加MYH IIB 型肌纖維相對表達量, 而Fhl1-ko對青年鼠腓腸肌中MYHI 型肌纖維相對表達量并沒有影響。在8 月齡小鼠中，Fhl1-ko 可以明顯增加腓腸肌中MYHI和MYH IIA型肌纖維相對表達量，而對MYH IIX 和MYH IIB 型肌纖維相對表達量沒有影響(圖3)。

3 討論

圖 2 不同月齡Fhl1-ko 型小鼠腓腸肌自噬水平變化

細胞自噬是真核生物對細胞內物質進行代謝和更新的重要過程，在小鼠發育的不同階段, 自噬水平和骨骼肌中肌纖維類型是動態變化的。在前期研究[15]中，我們發現2.5 月齡的Fhl1-ko 小鼠的脛骨前肌、肱三頭肌、腓腸肌(糖酵解型的II纖維組成)中自噬水平明顯增加，同時Fhl1-ko 可以明顯增加脛骨前肌中MYHI 型肌纖維含量，減少MYHXII型和MYHIIB型肌纖維的含量。但是，Fhl1-ko對不同年齡小鼠自噬水平和肌纖維分化的影響, 目前尚不清楚。因此, 本研究探討了2.5 月齡(青年小鼠)和8月齡(成年小鼠)Fhl1-ko小鼠腓腸肌中自噬水平和肌纖維相對表達量的變化。結果表明, Fhl1-ko 可以明顯激活青年小鼠(2.5 月齡)腓腸肌中Beclin1 介導的自噬水平，自噬流有受阻的表現(自噬激活時，P62 的降低是自噬流通暢的標記。2.5 月齡的Fhl1-ko 小鼠腓腸肌中自噬明顯激活，但P62 并沒有降低)。而Fhl1-ko 后對成年小鼠(8 月齡)的自噬激活沒有青年鼠明顯。不同年齡, 不同物種的骨骼肌中自噬水平變化的研究結果并不一致。有研究[16]表明, 與7～8 月齡的成年大鼠相比，老齡大鼠(24～26 月齡)的比目魚肌和腓腸肌中雖然自噬的上游通路激活，但其基礎自噬水平降低。然而，在犬類的研究中卻發現老齡犬的骨骼肌中有 LC3 II 和Beclin 1的激活, 提示自噬水平的增加是衰老性肌萎縮的原因之一[17]。在研究衰老對Fischer 344 大鼠跖肌肌肉組織中自噬和凋亡的影響時發現, 自噬調節蛋白Beclin-1在 衰老的跖肌肌肉組織中表達上調[18]。本文結果提示,Fhl1-ko 對青年小鼠(2.5 月齡)和成年小鼠(8 月齡)腓腸肌中自噬與自噬流的影響不同。有研究[19]表明，骨骼肌組織中特異肌纖維的含量受年齡影響。與老齡鼠相比，3 月齡的青年大鼠的比目魚肌中MYHIIA 型肌纖維含量較高，MYHI 型肌纖維含量較少。小鼠的腓腸肌的肌肉質量在7 月齡時達到峰值, MYH IIA 型肌纖維含量、肌纖維大小和肌肉的收縮能力在8 月齡時達到峰值[20]。

圖 3 不同月齡Fhl1-ko 型小鼠腓腸肌肌纖維相對表達量

在青年鼠中，Fhl1-ko 可以明顯降低腓腸肌中MYH IIA, MYH IIX 型肌纖維相對表達量, 同時明顯增加MYH IIB 型肌纖維相對表達量, 而Fhl1-ko對2.5月齡腓腸肌中MYHI型肌纖維相對表達量并沒有影響。在成年鼠中，Fhl1-ko 可以明顯增加腓腸肌中MYHI 和MYH IIA 型肌纖維相對表達量，而對MYH IIX 和MYH IIB 型肌纖維相對表達量沒有影響。本文結果表明，Fhl1-ko 對青年小鼠(2.5月齡)和成年小鼠(8月齡)腓腸肌中肌纖維的含量影響不同，提示Fhl1-ko 對不同年齡小鼠骨骼肌收縮能力的影響是不同的。

自噬在維持骨骼肌功能中發揮重要作用，有研究[21]表明，通過調節自噬信號通路可以作為治療年齡相關的少肌癥的潛在治療手段。本文結果表明，Fhl1-ko 對青年小鼠(2.5 月齡)和成年小鼠(8 月齡)腓腸肌中自噬的影響不同。提示調節自噬水平可能是FHL1 基因突變和蛋白缺失所致的骨骼肌肌病的潛在治療手段，并且針對不同年齡段的患者應采用差異化的精準治療手段。