不同pH環境下二價離子對聚電解質鏈的影響

李樹行，祝澤棟，徐紫顏，楊光參

(溫州大學數理與電子信息工程學院，浙江 溫州 325035)

DNA是一種高度帶電的聚電解質，可以緊密包裝在細胞核、細菌細胞質和病毒衣殼中。因此，DNA縮合不僅對于生物系統中遺傳物質的包裝過程起著重要作用，而且在人工基因遞送中具有潛在的治療應用價值。對DNA等聚電解質性質的研究，有助于我們更清晰地了解DNA構型變化的電動力學機理。通常在細胞中發現的多價陽離子是多胺，例如三價亞精胺和四價精胺，都受到高度調節，在細胞增殖和生長中發揮重要作用[1]。但是多胺代表的是具有陽離子基團(氨基)的化合物，而不是金屬離子。

在生物細胞中最常見的抗衡離子是金屬抗衡離子，如Na+、K+、Ca2+和Mg2+。并且通常情況下，一價與二價陽離子在溫和條件以及一般的摩爾濃度下不能導致DNA縮合，盡管其對DNA骨架具有高親和力以中和大部分DNA電荷。近幾年對DNA包裝和細胞骨架組織等各種生物現象的研究變得熱門起來，這使得對抗衡離子介導下的聚電解質構型變化的研究變得非常重要[2-3]。在早期的Oosawa-Manning凝聚理論中將抗衡離子分為“游離離子”和“聚集離子”[4-6],游離的抗衡離子充斥在溶液里，聚集的抗衡離子位于聚合物主鏈附近的小體積內。這個理論系統給出了反離子與聚電解質的作用機制，并且指出只有三價以上的多價離子才能誘導聚電解質縮合。隨后，Katchalsky模型[7]對抗衡離子分布給出了更嚴格的描述,該模型能夠使反離子和聚合物的自由度解耦合，從而可以提供平衡離子密度分布固定的理想聚合物構象。Ou 等[8]采用郎之萬動力學方法研究了均勻帶電半柔性聚電解質鏈上反離子凝聚的性質及其伴隨構型，考察了鏈剛度、鏈長、反離子價態和靜電相互作用強度對反離子凝聚的影響。在近期，Hofzumahaus等[9]采用蒙特卡羅方法對弱聚電解質微凝膠的構象與pH的依賴關系進行了模擬的，這對我們改變模擬pH環境提供了理論基礎。盡管到目前為止關于抗衡離子對DNA的凝聚的理論模擬和實驗研究已經很多[10-14]，但是關于非特異性結合的二價抗衡離子導致DNA凝聚的現象研究很少。

我們分別運用理論模擬和實驗的方法，通過改變溶液的pH環境，清楚地證明了由二價抗衡離子介導的聚電解質(DNA)的構象變化，主要工作是對實驗的結果進行模擬研究。事實上，嚴格調節細胞內pH以優化許多酶的活性，對于控制細胞周期和細胞的增殖能力是重要的。另一方面，pH調節的基于DNA的納米材料和納米器件在體內成像、臨床診斷和藥物遞送方面都有一些應用[15-18]。

1 模擬方法

1.1 模型創建

我們在隱性溶劑條件下利用粗粒化模型來研究含有聚電解質和帶+2價反離子的水溶液體系。聚電解質被模型化為一個由Lennard-Jones(LJ)粒子組成的彈簧鏈，聚電解質鏈上每個珠子隨機帶有1或0個單位的負電荷，反離子為帶兩個正電荷的球體,聚電解質分子和反離子置于均勻介電常數為εr的介質中，模擬區域為L×L×L的立方體盒子,模型簡單示意圖可參見圖1。

圖1 聚電解質鏈與反離子作用模型簡圖Fig.1 Schematic of the polyelectrolyte chain and anti-ion interaction model

單體間的相互作用勢選用排斥性的LJ勢：

(1)

其中，dαβ(α，β=1，2，3表示單體的類別，α=β表示同一種單體)是力為零的距離，兩個聚合物珠子排斥距離設定為dαβ=1σ，其中σ為模擬系統中長度基本單位，這里珠子與抗衡離子、抗衡離子與抗衡離子之間的排斥分別取為0.8σ和0.6σ。rij表示兩個珠子之間的距離，在這項工作中，能量單位參數ε=kBT，其中kB是Bolztmann常數，T是絕對溫度。

采用標準簡諧彈性勢對聚電解質鏈連通性進行建模:

(2)

其中，k是彈性參數，為了限制聚電解質珠子在鏈的方向保持小范圍振動，設置k=10 000kBT/σ2,其中，l0為平衡距離，大小為σ。

聚電解質鏈的彎曲能選用簡諧角的形式：

(3)

其中，θ0為角度平衡時的值，取為1800，k'是體現鏈剛性的參數。

任意兩個單體之間的庫侖相互作用，我們用以下形式描述：

(4)

其中,Bjerrum長度定義為lB=e2/4πε0εrkBT，其中ε0和εr分別是真空的介電常數和溶劑的相對介電常數,庫侖作用強度用A=lB/σ描述,本研究我們選取的A為4.0,庫侖相互作用的計算采用ewald求和法。所有的模擬都是從隨機生成的初始配置開始的。每個模擬總的時間步數都在5×107以上，以保證系統達到平衡,每隔1000個模擬步數要保存所有粒子的位置和速度數據。

1.2 模擬細節

我們通過LAMMPS(大規模原子/分子并行仿真器)軟件包進行分子動力學(MD)仿真來研究系統的動力學過程，整個模擬環境運用Langevin恒溫器在NVT系宗中保持恒溫。為了提高計算效率，我們忽略了流體動力學相互作用,這種粗粒度方法，使得我們的模擬涵蓋更大的長度和時間尺度。

系統中任何單體的動力學行為滿足郎之萬方程：

(5)

我們通過計算不同pH-pK值來研究不同pH對聚電解質縮合的影響，所有的值都是系統的平均值。對于聚電解質滿足以下方程:

HMH++M-，

(6)

其中，M代表高分子電解質。上述反應可以用一個解離常數來描述，即：

(7)

其中，x(H+)，x(HM)和x(M-)表示離解質子、相關酸及堿的濃度。同時我們可以定義電離度α：

(8)

電離度α和pH滿足以下關系[19]:

(9)

當pK固定時(pK=-lgK)，通過調節α的值，可以得到不同的pH環境。而α的調節可以通過改變聚電解質鏈的帶電比率來實現。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

AFM型號是NanoWizard III，購自于 JPK公司，其分辨率大約為納米級，比光學衍射極限高出1000倍以上，通過用機械探針“感覺”或“觸摸”表面來收集信息。壓電元件有助于實現微小但精確的(電子)命令運動，從而實現精確掃描，主要應用于單分子DNA的操縱實驗。在AFM內部安裝有自動化機器人以及一架可操作的控制裝置，還包含NanoScience 控溫系統。機械探針購自于NanoWorld，型號為NCHR-50的鍍鋁硅探針。探針參數為：長寬厚度分別是125 μm、30 μm、4 μm，彈性系數為2 N/m，共振頻率為320 kHz。在整個實驗過程中環境溫度保持室溫。使用AC mode掃描圖像，圖像尺寸5 μm×5 μm，掃描頻率維持1 Hz。圖像處理采用自帶的處理軟件(4.2版的JPK Data Processing)對所有圖片做相同的處理，圖片像素為512×512。實驗所用的緩沖液為10 mmol/L的Tris溶液，超純水來自于Milli-Q系統(Millipore,Billerica, MA, USA)。MgCl2·6H2O購于奧里奇西格瑪公司，配置的初始濃度為100 mmol/L。本實驗所用的Mg2+濃度為 3 mmol/L。

2.2 實驗方法

整個實驗過程可分為以下5個步驟：

(1)制備云母片，將云母片切割成1 cm×1 cm大小備用；

(2)用雙面膠將云母片平鋪到載玻片中間位置；

(3)使用磨砂膠帶剝離云母片，使其表面光滑完整待用；

(4)云母片處理好后，用移液器取出50 μL實驗溶液至云母片中央，用玻璃器皿將其罩上靜置5 min；

(5)5 min過后，取出樣品，吸取表面多余溶液，并用50 μL去離子水多次(10次左右)清洗，用氮氣吹干表面后再置于烘干箱中烘干1 h備用。

簡單流程如圖2所示。

圖2 樣品制備流程圖Fig.2 Sample preparation flow chart

3 實驗結果

3.1 理論模擬結果

為了表征pH對聚電解質鏈的聚集的影響，我們對不同pH-pK下聚電解質的Rg做了統計平均。圖3給出了不同鏈長的聚電解質Rg隨pH-pK的變化規律,其中回轉半徑Rg滿足公式：

(10)

其中，rc表示聚電解質質量中心的坐標，ri表示聚電解質中第i個單體的坐標。

由圖3中可以看到，在-1.50(即α>0.5)時，Rg基本不隨α的變化而改變(pH-pK=-1.5時，Rg=7.2σ；pH-pK=0時，Rg=9.0σ)。隨著pH的降低，聚電解質的回轉半徑也隨之降低。

圖3 回轉半徑Rg與pH-pK的關系Fig.3 Radius of gyration Rg for a chain of a particular length and some values of pH-pK

我們在二價離子溶液中研究了多種不同的聚電解質系統，將pH-pK=0時的系統作為參考系統。從參考系出發，研究了另外多組系統，只改變一個參數α(電離度)，并保持所有其他參數不變。我們從中選取了4組不同系統(對應的α分別為0.9、0.5、0.3、0.1)做了模擬快照圖，如圖4所示。隨著α的減小，pH是降低的，我們從圖4中能明顯地看出聚電解質的構型變化。所有的模擬數據均在體系能量達到最小時進行收集，其能量隨時間步數的變化結果，如圖5所示(圖5是許多模擬中的一個普通個例)。

圖4 模擬快照圖Fig.4 Simulation snapshots

圖5 模擬系統總能量隨時間的變化Fig.5 The change in the total energy of the simulation system with time

3.2 實驗結果

為了證實當前的模擬結果，我們做了pH對二價反離子介導的DNA形態影響的實驗研究。本研究使用AFM觀察了在不同離子和pH條件下的DNA構象變化，DNA的濃度為1 ng/μL。圖6給出了pH=8、5、4、3的3 mmol/L MgCl2溶液中的DNA形態，在pH = 5時，DNA呈現出自由松散的狀態，并且形態類似于pH>5的形態。當pH從5變為4時，觀察到圖6中DNA發生了聚集，中間有個核狀結構，周圍分布著DNA的線條，我們稱為花狀形態。而當pH在圖6中降至3時，出現球狀或環狀形態。由此可以看出隨著pH的降低，DNA發生了凝聚，這和我們的理論模擬基本保持一致。

圖6 不同pH下3 mmol/L Mg2+誘導的DNA形態的AFM圖像Fig.6 The AFM images of the DNA morphologies induced by 3 mmol/L Mg2+ at different pH

4 結論

我們通過模擬在各種pH環境下聚電解質鏈在二價反離子環境中的構象變化，發現當非特異性結合的抗衡離子中溶液的pH-pK降至低于0(即α=0.5)時，聚電解質鏈開始收縮。當環境pH-pK約為-0.37(即α=0.3)時，聚電解質處于不穩定的過渡狀態，相應的實驗也證實了模擬工作的正確性。當溶液的pH降低時，DNA的質子化能力變強，DNA鏈上被中和的磷酸基團變多，使得DNA的負電性變弱，進而更容易導致DNA凝聚。該結果為以后DNA和蛋白質等生物聚電解質鏈的實驗以及理論研究奠定了基礎。