慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA含量對(duì)IL-12誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生Th1/Th2類細(xì)胞因子協(xié)同效應(yīng)的影響

宋潔 邵雪 賈勝男

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B)是威脅現(xiàn)代人健康的一種常見(jiàn)疾病，其主要病因是HBV感染，嚴(yán)重者可危及患者生命，治療的關(guān)鍵在于抗病毒治療[1]。本病HBV DNA復(fù)制可干擾正常免疫系統(tǒng)功能，通過(guò)判斷血清HBV DNA含量可對(duì)機(jī)體清除HBV的能力進(jìn)行反映，進(jìn)而研究其對(duì)干擾素效果的影響[2]。我院近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA含量對(duì)IL-12(白細(xì)胞介素-12)誘導(dǎo)其PBMC產(chǎn)生Th1/Th2類細(xì)胞因子協(xié)同效應(yīng)具有重要作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2017年1月至2018年6月我院收治的慢性乙型肝炎患者120例，對(duì)所有患者的血清乙肝病毒的脫氧核糖核酸(HBV DNA)含量進(jìn)行測(cè)量，對(duì)不同血清HBV DNA含量的患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生Th1/Th2類細(xì)胞因子含量進(jìn)行測(cè)量。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均符合慢性乙型肝炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；(2)所有患者均為住院患者或者是傳染科門診患者；(3)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)患者的乙肝表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間>半年，ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)水平>60U/L；(4)所有患者均知曉同意此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴隨有其他惡性腫瘤的患者；(2)精神失常的患者；(3)臨床資料不完整的患者。此次研究的患者為120例，男88例，女32例，年齡20～68歲，平均年齡(50.4±2.5)歲；所有患者一般資料具有存在可比性(P>0.05)，研究獲得了我院倫理委員會(huì)審核與批準(zhǔn)。

二、方法

外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)與因子檢測(cè)：所有患者均在入院后的第二天清晨采集空腹靜脈血13 mL，對(duì)其中的3 mL進(jìn)行離心分取血清，后保存在-20℃的條件下，待檢測(cè)。剩余10 mL在其中加入500單位的肝素進(jìn)行抗凝，后應(yīng)用凡影葡胺密度梯度法在2 h內(nèi)對(duì)PBMC進(jìn)行分離記數(shù)。在溶液中加入100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、10%活小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液將濃度調(diào)整為1.0×106個(gè)/mL，后將其移入到48孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別在培養(yǎng)孔中加入抗原純度>99%的重組HbeAg 1 μg/mL、重組HbcAg 1 μg/mL重組，由西安廣華生物公司提供；加入100 pg/mL聚羥基脂肪酸酯(PHA)。抗原單獨(dú)或者是與10 ng/mL IL-12聯(lián)合放置在溫度為37℃，5%的CO2孵箱中培養(yǎng)大約48 h,后對(duì)其進(jìn)行離心分取血清，應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法對(duì)IL-12(白細(xì)胞介素-12)、IFN-γ(γ-干擾素)、IL-4(白細(xì)胞介素-4)、IL-10(白細(xì)胞介素-10)因子含量進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒由Genayme公司提供，在進(jìn)行此項(xiàng)操作要嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行[4]。

血清乙肝病毒的脫氧核糖核酸(HBV DNA)含量檢測(cè)：應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)，試劑盒由中山醫(yī)科大學(xué)提供，在進(jìn)行此項(xiàng)操作時(shí)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。應(yīng)用PE5700全自動(dòng)分析儀對(duì)樣品拷貝數(shù)值(M)進(jìn)行自動(dòng)的計(jì)算，1000×M= HBV DNA(基因拷貝數(shù)/mi)含量[5]。

丁型肝炎病毒(HDV抗體)、戊型肝炎病毒(HEV抗體)、丙型肝炎病毒(HCV抗體)、血清標(biāo)本乙肝病毒標(biāo)志物(HBVM)檢測(cè)：應(yīng)用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)[6]。試劑盒由3V公司提供，在進(jìn)行此操作時(shí)要嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

三、觀察指標(biāo)

分析所有慢性乙型肝炎患者HBV DNA含量檢測(cè)結(jié)果。分析不同血清HBV DNA含量的患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生Th1/Th2類細(xì)胞因子含量。比較e抗原陽(yáng)性患者與e抗原陰性患者PBMC產(chǎn)生的Th1/Th2類細(xì)胞因子含量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、所有慢性乙型肝炎患者HBV DNA含量檢測(cè)結(jié)果分析

HBV DNA含量<103拷貝/mL的患者21例，在103～105拷貝/mL之間的患者37例，在105～107拷貝/mL之間的患者32例，>107拷貝/mL的患者30例。

二、不同血清HBV DNA含量的患者PBMC產(chǎn)生Th1/Th2類細(xì)胞因子含量分析

隨著HBV DNA含量升高，抗原單獨(dú)誘導(dǎo)或者是與IL-12一同誘導(dǎo)，PBMC產(chǎn)生Th1類細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ的含量不斷下降，而Th2類細(xì)胞因子IL-4、IL-10的含量不斷增高。抗原單獨(dú)誘導(dǎo)與聯(lián)合IL-12一同誘導(dǎo)相比較，隨著HBV DNA含量升高，IL-12對(duì)PBMC產(chǎn)生的IFN-γ細(xì)胞因子協(xié)同效應(yīng)不斷下降，尤其對(duì)于>107拷貝/mL的患者基本無(wú)協(xié)同效應(yīng)。對(duì)于<103拷貝/mL的患者，IL-12對(duì)HbeAg誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生的IL-4細(xì)胞因子有顯著的抑制作用、在103～105拷貝/mL之間的患者，對(duì)IL-4細(xì)胞因子、IL-10細(xì)胞因子有顯著的抑制作用，見(jiàn)表1，表2。

表1 不同血清HBV DNA含量的患者PBMC產(chǎn)生Th1類細(xì)胞因子含量分析(pg/mL，±s)

注：與血清HBV DNA<103對(duì)比，aP<0.05，bP<0.05；IL-12+PHA+HBcAg與IL-12+HBcAg+HBeAg比較，cP<0.05，dP<0.05。

三、e抗原陽(yáng)性患者與e抗原陰性患者PBMC產(chǎn)生的Th1/Th2類細(xì)胞因子含量對(duì)比

e抗原陰性患者PBMC產(chǎn)生的IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子高于e抗原陽(yáng)性患者(P<0.05)，e抗原陰性患者PBMC產(chǎn)生的IL-10細(xì)胞因子含量低于e抗原陽(yáng)性患者(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 e抗原陽(yáng)性患者與e抗原陰性患者PBMC產(chǎn)生的Th1/Th2類細(xì)胞因子含量對(duì)比(±s)

討 論

通過(guò)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者的血清HBV DNA含量，可有效判斷機(jī)體對(duì)HBV的清除功能。本次研究結(jié)果提示，隨著HBV DNA含量升高，抗原單獨(dú)誘導(dǎo)或聯(lián)合IL-12誘導(dǎo)時(shí)，PBMC產(chǎn)生Th1類細(xì)胞因子的含量不斷下降，而Th2類細(xì)胞因子的含量不斷增高。隨著HBV DNA含量升高，IL-12對(duì)PBMC產(chǎn)生的IFN-γ細(xì)胞因子協(xié)同效應(yīng)不斷下降，尤其對(duì)于>107拷貝/mL的患者基本無(wú)協(xié)同效應(yīng)；對(duì)于<103拷貝/mL、103～105拷貝/ml的患者，對(duì)Th2類細(xì)胞因子有顯著的抑制作用。

結(jié)果分析，IL-12可增強(qiáng)Th1類、抑制Th2類細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答；而HBV DNA復(fù)制可引發(fā)體液免疫反應(yīng)，并發(fā)誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，進(jìn)而不斷破壞肝組織，造成病情遷延難愈[7]。臨床干預(yù)中若抑制HBV DNA復(fù)制，有利于改善細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)IL-12對(duì)Th1類細(xì)胞因子的協(xié)同效應(yīng)，抵抗乙型肝炎病毒[8]。

綜上所述，慢性乙型肝炎患者的血清HBV DNA含量升高會(huì)抑制IL-12對(duì)Th1類細(xì)胞因子的協(xié)同效應(yīng)，治療中降低血清HBV DNA含量可顯著增強(qiáng)此協(xié)同效應(yīng)，建議行進(jìn)一步大樣本量研究及臨床推廣。