薏苡種質資源ISSR分子標記篩選及親緣關系分析

陸秀娟 潘虹 李祥棟 魏心元 陸平 石明

摘要：利用ISSR標記對92份薏苡種質進行遺傳多樣性分析，結果表明，從100條ISSR通用引物中篩選出11條多態性較好的引物，共擴增出49條多態性條帶，多態性條帶占各自總條帶的比例為66.6%～100.0%;非加權組平均法（UPGMA）和主成分分析法（PCA）對92份薏苡種質的聚類結果一致，均分為3個類群，云南、貴州、福建3個省份的種質表現出比較豐富的遺傳多樣性，其他省份的多樣性水平相對較低。

關鍵詞：ISSR標記;遺傳多樣性;種質資源;薏苡;類群;主成分分析

中圖分類號： S519.024? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0032-05

收稿日期：2018-04-23

基金項目：貴州省科技計劃（編號：黔科合重大專項字[2014]6023、黔科合支撐[2016]2608）;貴州省高層次創新型人才培養項目（編號：黔科合人才[2015]4016）。

作者簡介：陸秀娟（1989—），女，布依族，貴州冊亨人，從事作物栽培與生物技術研究。E-mail：lowaterve_643@126.cm。

通信作者：李祥棟，農藝師，從事植物生理與分子調控研究，E-mail：lixiangdongsiji@163.com;石 明，研究員，從事作物遺傳育種研究，E-mail：shiming1616@126.com。

種質資源的遺傳多樣性是育種的基礎，科學、準確地評價種質資源的遺傳多樣性，從整體上把握物種資源的遺傳變異信息及親緣關系遠近，可有針對性地選擇合適親本，為遺傳育種工作提供有益參考。

薏苡（Coix lacryma-jobi L.）是禾本科薏苡屬1年生或多年生草本植物，是重要的藥食同源作物之一。目前，薏苡屬作物在世界范圍內約有10個種或變種，《我國植物志》將薏苡屬分為5個種4個變種[1]。DNA分子標記是研究遺傳多樣性和親緣關系的重要工具，近年來，Qin等采用擴增片段長度多態性（AFLP）、相關序列擴增多態性（SRAP）、簡單重復序列標記（SSR）等分子標記方法對薏苡種質進行篩選應用[2-5]。Ma等利用17對SSR引物聚類分析來自我國和韓國的79份薏苡種質資源時發現，我國薏苡和韓國薏苡有著比較遠的親緣關系，大部分我國薏苡聚為1類，而所有的韓國薏苡被聚為1類[6]。江忠東等以薏苡（原變種）、念珠薏苡（變種）、薏米、水生薏苡、小珠薏苡等42份薏苡屬植物為材料，篩選出5對與落粒性基因相關的STS引物，并對薏苡屬植物的DNA多樣性進行了分析，根據DNA多態性特征討論了薏苡屬植物的遺傳進化關系[7]。當前，薏苡的基因組信息尚未公布，相關遺傳性研究所用的標記數量極為有限。簡單重復序列區間標記（inter-simple sequence repeats，ISSR）由于不需要知道研究材料的遺傳背景，多態性高、操作簡單，現已被廣泛應用于多種植物的遺傳多樣性研究[8-12]。本研究通過篩選ISSR分子標記，對薏苡種質遺傳多樣性和親緣關系進行分析，以期為薏苡優異資源的挖掘、品種改良和分子鑒定提供理論與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試薏苡種質材料共92份，其中，86份來自我國貴州、云南、福建等省份，5份來自老撾，1份來自韓國，詳見表1。

1.2 DNA提取

取薏苡飽滿籽粒，采用苗盤育苗;待生長至3～4葉，采用天根植物新型基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，紫外分光光度法檢測DNA濃度。

1.3 ISSR擴增

將DNA稀釋至30～50 ng/μL再進行擴增。PCR反應總體系為20 μL：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，10 μmol/L引物1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，45～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環;72 ℃延伸5 min。12 ℃保存，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行ISSR分型檢測，ISSR引物來自網絡公布的100條通用引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 結果調查與數據統計分析

觀察瓊脂糖凝膠電泳結果，記錄每個樣品在每個引物位點上條帶的有無，同一遷移位置有帶的記為1，無帶的記為0。采用Ntsys 2.10e軟件計算遺傳距離矩陣，并分別采用非加權組平均法（UPGMA法）、主成分分析（PCA）對親緣關系進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 ISSR引物的篩選和擴增條帶多態性

選取編號為71、72的樣品采用100條通用ISSR引物進行DNA擴增，由表2可見，共篩選得到11對多態性引物、49條多態性條帶，引物最佳退火溫度（Tm）在48～55 ℃之間;11對引物中每對引物的總擴增條帶數為3～10個，多態性條帶為3～8個，多態性條帶占比在66.7%～100.0%之間，其中，808、809、810、811、814、836、840、842、864這9對引物的多態性條帶占比為100.0%（圖1）。此外，從擴增效果看，篩選出的引物基序分別為（AG）n、（GA）n、（CT）n、（ATG）n，其中以（AG）n、（GA）n重復基序為主，這從側面反映出薏苡基因組AG、GA重復序列比較豐富，為下一步利用ISSR開發定向薏苡SSR標記創造了條件。

2.2 薏苡種質聚類分析

2.2.1 非加權組平均法（UPGMA） 由表3、圖2可見，以相似性系數0.57為標準，可將92份薏苡種質劃分為2個大類3個類群;第Ⅰ大類包含2個亞類，即Ⅰ-1亞類、Ⅰ-2亞類，第Ⅰ-1亞類共48份，占供試種質的52.17%，分別為我國云南15份、貴州13份、福建5份、湖南4份、河北2份、遼寧2份、浙江1份、江蘇1份、其他1份，老撾4份;第Ⅰ-2亞類共8份資源，占供試種質的8.70%，均來自我國，其中云南6份、貴州2份;第Ⅱ類共36份資源，占供試種質的39.13%，分別為我國云南8份、貴州9份、四川3份、福建3份、河北2份、山西2份、浙江1份、江蘇1份、山東1份、北京1份、其他3份，老撾、韓國各1份。從聚類結果整體來看，云南、貴州、福建3個省份的種質表現出較為豐富的遺傳多樣性，其他國家或地區的多樣性水平相對較低，這可能與不同地區供試種質數目的多少也有一定關系。

2.2.2 主成分分析法（PCA） 通過對92份薏苡種質進行主成分分析（PCA），結果表明，第一、第二主成分值分別為 13.73、3.28，貢獻率分別為34.12%、8.16%，前2個主成分的累積貢獻率為42.28%，并可將92份薏苡種質聚類分為A、B、C這3個類群（圖3）。主成分分析與UPGMA法聚類分析的結果基本一致，相比之下，類群A、B和Ⅰ-1、Ⅰ-2類群基本吻合，且2個類群的發散方向比較一致，均匯集成一個大類;類群C與類群A、B有不同的發散方向，且離遠點的距離較遠，因此，C類群與其他2個類群相比，具有更高的遺傳異質性。

3 結論與討論

種質資源遺傳多樣性評價是育種的基礎。ISSR標記屬顯性標記，具有多態性高、在不同作物中通用性強的優勢，被廣泛用于多種作物的品種鑒定及遺傳多樣性分析評價中，特別是適用于沒有參考基因組序列信息的物種。汪斌等利用ISSR標記結合SRAP、SSR標記，繪制了紅麻、黃麻的DNA指紋圖譜用于不同品種的分子識別[12-13];馬紅勃等采用篩選的68個ISSR和SRAP標記，構建了187個單株的F2連鎖遺傳圖譜，可用于煙草重要農藝性狀的基因定位和分子輔助選擇[14];李本英等篩選出18個ISSR標記，分析了18個種群134份云南茶樹種質的親緣關系和多樣性，全部材料間的相似系數為0.445～0.819，平均為0.512[15];李超等利用ISSR標記技術，分析163份新疆核桃種質的遺傳多樣性和遺傳結構時發現，居群間的遺傳距離與居群的地理距離之間具有較高的相關性[16];雒新艷等利用ISSR標記探討了5個瓣類大菊品種的遺傳多樣性、分化程度和親緣關系[17];劉娟等則利用ISSR標記遺傳距離結合不同取樣策略，構建了新疆野杏的核心種質[18]。夏發剛等利用16對SRAP引物初步構建了73份薏苡種質資源的DNA指紋圖譜，為薏苡遺傳研究、品種選育與資源保護提供了一定依據，但是在更多資源的指紋鑒定中卻力有未逮[19]。本研究從100對ISSR通用引物中篩選出11對多態性引物，可較好地劃分92份薏苡種質，在薏苡基因組信息未公布而分子標記相對缺乏的前提下，可用作薏苡分子指紋鑒定和遺傳多樣性研究的重要候選標記，并與有限的SRAP、SSR標記聯合使用，用于薏苡的遺傳分析。

一直以來，非加權組平均法（UPGMA法）聚類分析是遺傳多樣性、親緣關系分析的重要方法，而主成分分析在研究物種親緣關系、不同種群的地理生態分布等方面有所應用。聚類分析提供了豐富的數量信息，能夠量化地表現出不同種質間的關系[20];而主成分分析則從不同的方向和層面提供更多個體或居群之間的信息，能夠直觀、形象地描述種質資源或居群間的來源（或遺傳）差異[21]。有研究表明，種質資源個體或居群間的親緣關系往往和地理分布有一定的關聯性[22]，但也有例外，本研究將92份薏苡種質劃分為3類，但并不是來自同一地區的種質都聚在一起，如編號為75、76、77、78的樣品和編號為74、79、80的樣品均為福建來源種質，卻分別聚為2個類群，親緣關系和地理來源之間并未表現出明顯的關聯性，這可能與取樣的不均衡性和標記數量較少有關。張大樂等以聚類和主成分分析方法揭示了12個啤酒大麥品種的遺傳背景差異[23];宋燁等采用12對SSR引物，通過聚類和主成分分析將20個蘋果品種劃分為4個類群，比較準確地反映了不同蘋果品種的親緣關系和加工品質特點[24]。本研究通過非加權組平均法（UPGMA）和主成分分析法（PCA）對92份薏苡種質進行聚類分析，均分為3個類群，聚類結果基本一致，與前人的研究結論[23-24]相似。UPGMA聚類和主成分分析在遺傳關系聚類分析方面各有所長，可結合2種分析方法互為印證、補充，更準確地判斷不同個體或居群間的遺傳關系。

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